惡性瘧原蟲PfRNaseⅡ的克隆表達與降解特性的性狀分析論文

　　在真核生物中，DNA轉錄生成RNA，然而其中只有極少部分的RNA 編碼蛋白質，大部分基因組序列轉錄生成非編碼RNA (ncRNA)。ncRNA根據其功能的不同可分為持家ncRNA和調節ncRNA，其中調節ncRNA曾被認為是轉錄“噪音”。隨著測序技術的發展，越來越多的研究表明ncRNA可在轉錄、轉錄后以及表觀遺傳等水平來調控基因的表達，從而參與機體的生長發育、疾病發生以及病原體毒力相關基因的表達等過程。盡管RNA 在生物體中發揮重要作用，然而RNA的新陳代謝離不開核糖核酸酶特別是核糖核酸外切酶的參與。研究表明核糖核酸外切酶與病原體的毒力表型有關，其機制尚不清楚，可能與核糖核酸外切酶參與RNA的加工、降解、穩定等過程有直接或間接的聯系。惡性瘧原蟲是瘧疾的主要病原體之一，致病力強，致死率高，對人類的危害嚴重。

　　張青鋒等研究發現惡性瘧原蟲中存在一種核糖核酸外切酶PfRNaseⅡ，該酶通過降解新生RNA 從而介導與重癥瘧疾相關的毒力基因(upsA 亞類基因)的沉默。

　　本實驗通過體外擴增惡性瘧原蟲3D7株PfRNaseⅡ的催化活性區，構建重組表達載體，然后利用原核表達系統誘導表達GST標簽融合蛋白質，純化后進行RNA降解活性測定，為解析PfRNaseⅡ基因結構組成及其降解機制研究奠定基礎。

　　材料與方法

　　1材料

　　1.1蟲株與菌株大腸埃希菌DH5α、BL21-Codon-Plus(DE3)和惡性瘧原蟲3D7蟲株均由本室保存。

　　1.2主要試劑ExTaq? DNA 聚合酶，dNTP，DL2000TMDNAMarker，DL15000TMDNAMarker，限制性內切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，T4DNA 連接酶，pMDTM18-TVectorCloningkit均購自于大連寶生物公司;Glutathione-SepharoseTM4B 購于美國GEHealthcare公司;GST-tagMousemAb購自于天津三箭生物有限公司;堿性磷酸酶標記山羊抗小鼠IgG和BCIP/NBT購于美國Sigma公司;DNAGelExtractionKit和PlasmidMiniprepKit購于美國BIOMIGA公司;其他試劑均為國產或進口分析純。

　　2方法

　　2.1序列分析與引物合成根據瘧原蟲專業網站(www.plasmoDB.org)提供的序列信息，對惡性瘧原蟲3D7株PfRNaseⅡ (PF3D7_0906000)基因編碼區進行保守結構域分析，顯示該蛋白質氨基酸序列的870～1322區段為RNBdomain，該結構域是RNaseⅡ的特征性結構域和催化活性區。根據編碼序列設計特異性引物，并在引物的5'端分別添加酶切位點。上游引物：5′-GGATCCTTAGAAAAATATATGTTGAAAAGCT-3′(劃線部分為BamHⅠ酶切位點序列)，下游引物：5′-GAATTCAATATTATCTTGATCAATTAAACTTTGT-3′(劃線部分為EcoRⅠ酶切位點序列)。引物由長春庫美生物公司合成。

　　2.2目的片段的擴增以cDNA(本室保存)為模板，PCR擴增上述的目的基因片段。PCR 反應程序：94℃預變性4min;94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，共35個循環;72℃再延伸10min。擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

　　2.3重組表達載體的構建取PCR產物與pMD18-T載體連接，連接產物轉入DH5α后涂板，經PCR、測序鑒定為陽性的重組pMD18-T-PfRNaseⅡ載體質粒與原核表達載體pGEX-4T-1質粒分別進行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切(37℃酶切反應2.5h)，酶切產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按BIOMIGA試劑盒說明書切膠回收。將回收的載體片段與目的片段按摩爾比5︰1混合，在T4DNA連接酶的作用下于16℃水浴連接過夜，連接產物轉入DH5α后涂板，經PCR、雙酶切、測序鑒定正確的重組表達載體質粒pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ轉入BL21-CodonPlus(DE3)中。測序鑒定均由哈爾濱博仕生物公司完成。

　　2.4融合蛋白質的誘導表達與純化將轉染pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ的DE3劃線接種于固體LB培養基中37℃培養12h以上，挑取單個菌落接種于5ml液體LB中擴大培養。取適量菌液按1︰100接種繼續擴大培養，當A600值為0.6左右時，加入終濃度為100μmol/LIPTG誘導表達目的蛋白質。于16℃誘導表達12h后收集菌體，用適量TBS重懸，然后加入終濃度為1% TritonX-100和2mmol/L的PMSF混勻，超聲破碎菌體。用Glutathione-SepharoseTM4B樹脂純化目的蛋白質pGEX-PfRNaseⅡ。以相同的流程純化GST標簽蛋白質。純化的目的蛋白質用預冷的Tris緩沖液(TBS)透析，按說明書操作。為了便于PfRNaseⅡ的水解活性測定，在純化pGEX-PfRNaseII融合蛋白質和GST 標簽蛋白質時，全程盡量避免PO43-污染，故用TBS替換PBS。純化的目的蛋白質通過SDS-PAGE和Westernblot鑒定其濃度和純度。

　　2.5pGEX-PfRNaseⅡ水解活性測定反應體系為12.5μl，包含終濃度為0.8μmol/LpGEX-PfRNaseⅡ，20 mmol/LTris-HCl (pH =8.0)，100mmol/LKCl，5mmol/LMg2+，1U/μlRNasin和4μmol/L單鏈RNA(ssRNA)或2μmol/L雙鏈RNA(dsRNA)。同時設置等摩爾數的GST標簽蛋白為陰性對照。37℃孵育適當時間后加入等量含30mmol/LEDTA的上樣緩沖液終止降解反應。反應終產物進行20%7mol/L尿素變性聚丙烯酰胺凝膠(7mol/LU-PAGE)電泳檢測。ssRNA 和dsRNA 均由蘇州吉瑪公司合成。

　　2.6觀察鎂離子對pGEX-PfRNase Ⅱ 體外降解RNA的影響有研究表明，核糖核酸外切酶降解RNA需要二價金屬離子的參與。為了觀察Mg2+對pGEX-PfRNaseⅡ體外降解RNA 的影響，本實驗設置0～20mmol/L梯度濃度的Mg2+ 進行目的蛋白RNA水解活性測定定，反應體系中的其他成分與方法2.5一致。

　　結果

　　1目的片段的擴增以cDNA 為模板，利用PCR 方法擴增PfRNaseⅡ的RNB催化區(870～1322位氨基酸區段)的編碼基因，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，大小在1000～2000bp之間，與預期值(1404bp)相符，不含內含子的編碼區片段擴增成功。

　　2重組pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ表達載體的構建及鑒定按常規方法構建pMD18-T-PfRNaseⅡ重組T載體質粒和pGEX-4T-1 表達載體質粒，BamHⅠ 和EcoRⅠ雙酶切結果。回收載體和目的基因片段，于16℃連接過夜，構建重組pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ表達載體，經PCR、雙酶切、測序鑒定均正確，重組表達載體構建成功。

　　3目的蛋白質的表達純化及鑒定

　　pGEX-4T-1-PfRNaseⅡ轉染DE3后用終濃度為100μmol/LIPTG誘導12h，成功表達目的蛋白。純化的pGEX-PfRNaseⅡ融合蛋白和GST標簽蛋白的SDS-PAGE結果。以GST-tagMousemAb為一抗，堿性磷酸酶標記的山羊抗小鼠IgG 為二抗，進行Westernblot，目的蛋白能被相應一抗識別。根據SDS-PAGE 結果估計融合蛋白pGEXPfRNaseⅡ濃度約為80μg/ml，GST標簽蛋白質濃度為500μg/ml。

　　4pGEX-PfRNaseⅡ的水解活性

　　將pGEX-PfRNaseⅡ與ssRNA 混合后于37 ℃孵育30min即可見明顯的降解發生，等量的GST標簽蛋白與等量的ssRNA在37℃孵育120min后仍無明顯的降解發生。在同等條件下，pGEX-PfRNaseⅡ和GST標簽蛋白均不能降解dsRNA。

　　5二價金屬離子對pGEX-PfRNaseⅡ催化活性的影響

　　為了確定Mg2+ 對PfRNaseⅡ酶活性的影響，實驗設置0(EDTA組)、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20mmol/L共10個Mg2+ 梯度。在不同Mg2+ 條件下，pGEX-PfRNaseⅡ與ssRNA 在37 ℃孵育90min后經20%7mol/LU-PAGE檢測，呈現不同的降解效果。在低濃度Mg2+ 條件下，pGEX-PfR-NaseⅡ降解活性較強;而在EDTA的存在下，pGEXPfRNaseⅡ的活性受到明顯抑制。表明Mg2+ 為pGEX-PfRNaseⅡ發揮降解活性所必需，且在低濃度時活性較強，高濃度時活性受到抑制。

　　討論

　　瘧疾是由瘧原蟲感染引起的寄生蟲病，通過受感染的蚊蟲叮咬傳播。世界衛生組織最新報告顯示，全球大約有32億人口仍處于瘧疾感染的威脅下，僅2015年就新增加2億感染病例和40多萬的死亡病例。雖然人類的抗瘧行動取得了一定成績，但隨著蟲體耐藥性的產生和擴散，研制開發有效的疫苗和新型抗瘧藥物刻不容緩。解析瘧原蟲的抗原變異機制和關鍵毒力基因的調控機制，對研制新型瘧疾疫苗或藥物具有重要意義。

　　大量研究證實，由Var基因家族編碼的惡性瘧原蟲紅細胞膜抗原1(PfEMP1)是蟲體抗原變異的主要效應分子，也是介導細胞粘附和玫瑰花環形成的重要致病因子，在惡性瘧原蟲免疫逃避和蟲體致病中發揮重要作用。因此，Var基因的調控機制一直是瘧疾研究領域的重點和熱點。雖然關于Var基因的調控已經在轉錄水平和表觀遺傳水平取得一定的進展，但關于Var基因完整的調控網絡尚不十分清楚。Zhang等報道惡性瘧原蟲PfRNaseⅡ通過降解新生的RNA介導與重癥瘧疾相關的毒力基因，首次從轉錄后水平研究Var基因的調控機制，這對完善Var基因的調控機制具有重要意義。

　　生物信息學分析PfRNaseⅡ序列發現，該蛋白870～1322氨基酸殘基區段為RNB結構域。RNB結構域是RNB家族成員特征性的功能結構域，屬保守功能域，而RNB家族成員又是核糖核酸外切酶的重要組成部分。本研究利用原核表達系統制備含PfRNaseⅡ預測的RNB功能區的GST 標簽融合蛋白。體外RNA 降解試驗顯示該蛋白可水解ssRNA 而不能水解dsRNA，且其降解ssRNA的活性受反應體系中Mg2+ 濃度的影響。可見，PfRNaseⅡ具有ssRNA水解活性，其水解反應需要二價金屬離子的參與，為PfRNaseⅡ的降解機制及其在瘧原蟲生長發育中的作用研究奠定了基礎。

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