測(cè)定復(fù)方養(yǎng)血生發(fā)片中二苯乙烯苷的含量

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　　【摘要】 高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方養(yǎng)血生發(fā)片中何首烏有效成分二苯乙烯苷(2,3,5,4′?四羥基二苯乙烯?2?O?β?D?葡萄糖苷)的含量。方法 流動(dòng)相為乙腈?1%磷酸 (體積比15∶85);色譜柱為C18 柱;紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。結(jié)果 二苯乙烯苷在1.04～3.64 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系;平均回收率為99.36%，RSD為0.41%(n=9)。結(jié)論 該方法靈敏度、專屬性高、重現(xiàn)性好，快速簡(jiǎn)便。

　　【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法 二苯乙烯苷 復(fù)方養(yǎng)血生發(fā)片

　　復(fù)方養(yǎng)血生發(fā)片是由當(dāng)歸、地黃、五味子、制何首烏、熟地、木瓜等中藥材制成的復(fù)方制劑。制何首烏具有補(bǔ)肝腎、益精血、烏須發(fā)的功效，主要含二苯乙烯苷(2,3,5,4′?四羥基二苯乙烯?2?O?β?D?葡萄糖苷)、大黃素、大黃酸等成分[1]。二苯乙烯苷為何首烏的特征成分,其含量測(cè)定方法有紫外分光光度法[2-3]、高效液相色譜法[4]，但在藥品標(biāo)準(zhǔn)中均沒(méi)有收載。本文采用高效液相色譜法對(duì)其制劑中二苯乙烯苷含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠，可以作為有效的質(zhì)量控制方法。

　　1 儀器與試藥

　　Waters高效液相色譜儀，1525Binary Pump高壓梯度泵，Rheodyne7725iw/1500Mount進(jìn)樣閥， 2487Dual Wavelength UV Detector檢測(cè)器，Breeze data management software Add?on kit液相色譜工作站。

　　復(fù)方養(yǎng)血生發(fā)片(廣東怡康制藥有限公司生產(chǎn))，二苯乙烯苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，供含量測(cè)定用，批號(hào)：0844?9802)，乙腈(色譜純，Huneywell International Inc.)，其他試劑均為分析純。

　　2 方法驗(yàn)證與結(jié)果

　　2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

　　色譜柱：Xterra column C18分析柱(5 μm，3.9 mm×150 mm);流動(dòng)相：乙腈?0.1%磷酸水溶液(體積比20∶80) ;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm;理論板數(shù)不低于3 000。

　　2.2 供試品溶液的制備

　　取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉約0.5 g，置三角瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流60 min，濾過(guò)，用少量甲醇洗滌，合并濾液和洗液，揮干，殘?jiān)�加�?0 mL使溶解，乙醚萃取兩次，每次20 mL，水層加飽和正丁醇萃取4次，每次15 mL,合并正丁醇液，揮干，用流動(dòng)相溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

　　2.3 對(duì)照品溶液的制備

　　精密稱取二苯乙烯苷對(duì)照品適量，用流動(dòng)相稀釋制成每1 mL含0.26 mg的溶液，即得。

　　2.4 線性試驗(yàn)

　　精密吸取二苯乙烯苷對(duì)照品溶液(0.26 mg/ mL)，用流動(dòng)相稀釋成每1 mL含二苯乙烯苷0.052、0.078、0.104、0.156、0.182 mg的溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定。以峰面積積分值(A)為縱坐標(biāo)，二苯乙烯苷的量(m)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A= 1.778×106m+6.958×104 ，r=0.999 5。表明二苯乙烯苷在1.04～3.64 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

　　2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

　　取供試品溶液分別于0、2、4、8、24 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.210 mg/g，RSD=1.85%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

　　2.6 精密度試驗(yàn)

　　精密吸取對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積,結(jié)果平均峰面積為456 799.6，RSD=0.72%。

　　2. 7 重復(fù)性試驗(yàn)

　　配制同一批號(hào)樣品5份，分別進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.405 5 mg/g，RSD=1.85%。

　　2. 8 回收率試驗(yàn)

　　采用加樣回收法，精密稱取已知含量樣品(1.405 5 mg/g)0.40 g，定量分別加入濃度為0.40、0.50、0.60 mg/mL的二苯乙烯苷對(duì)照品溶液各1 mL，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣20 μL進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果平均回收率為99.36%，RSD=0.41%，見(jiàn)表1。

　　2. 9 樣品測(cè)定

　　分別精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算二苯乙烯苷含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

　　3 討 論

　　3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

　　參照《中國(guó)藥典2000版》中何首烏藥材的含量測(cè)定方法選用320 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)表1 二苯乙烯苷回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表2 6批樣品含量測(cè)定結(jié)果

　　3.2 提取方法的選擇

　　比較了用甲醇為溶劑超聲波處理30 min、加熱回流30 min、索氏回流4 h 3種方法，甲醇加熱回流所制備的供試品溶液二苯乙烯苷含量較高，故選擇加熱回流作為提取方法。

　　3.3 提取時(shí)間的選擇

　　通過(guò)對(duì)加熱回流提取30 min,60 min,90 min的比較，提取60 min，含量測(cè)定值較高，故提取時(shí)間選擇為60 min。

　　3.4 純化方法的選擇

　　比較了用甲醇提取后直接進(jìn)樣測(cè)定，乙醚萃取后再用飽和正丁醇萃取，上氧化鋁柱(200 目，10 g，d=1.5 cm)，上C18小柱(3 g)等多種方法，最后采用乙醚萃取后再用飽和正丁醇萃取的方法。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:一部[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2000：139.

　　[2] 陸瑞蘭.一階導(dǎo)數(shù)光譜法測(cè)定何首烏中總二苯乙烯苷的含量[J].中成藥，1990(3)：16-18.

　　[3]白研，陳志澄，毋福海,等.廣東德慶與廣西宜州首烏中二苯乙烯苷含量測(cè)定[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，18(2)：101-102.

　　[4] 張純.高效液相色譜法測(cè)定何首烏中二苯乙烯苷的含量及其穩(wěn)定性考察[J].中國(guó)中藥雜志，1999(6)：37-39.

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