耐高溫乳酸菌的分離與鑒定

　　耐高溫乳酸菌的分離與鑒定【1】

　　【摘要】 目的：本實(shí)驗(yàn)從不同地方采集的青貯玉米飼料、果渣、牛奶、新鮮的泡菜汁等樣品中篩選耐高溫乳酸菌。

　　方法：通過初篩、復(fù)篩，獲得一株耐高溫且產(chǎn)酸能力較強(qiáng)的菌株L1;依據(jù)伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)和乳酸菌分類鑒定的標(biāo)準(zhǔn)和描述，對(duì)其進(jìn)行了生理生化特性鑒定;通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定菌株L1的最佳發(fā)酵條件。

　　結(jié)果：確定其為乳桿菌屬德氏乳桿菌;最佳增殖培養(yǎng)基組分為：玉米粉16%+麩皮5%;在α-淀粉酶(5 U/g玉米粉、90 ℃、30 min)和糖化酶(150 U/g玉米粉、55 ℃、2 h～3 h)酶解作用下，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度60 ℃，發(fā)酵時(shí)間36 h，pH值3.5。

　　結(jié)論：經(jīng)過初篩、復(fù)篩獲得一株耐高溫菌株L1，通過糖發(fā)酵等生理生化試驗(yàn)、正交試驗(yàn)鑒定，最后確定此菌株為乳桿菌屬德氏乳桿菌(LacotobaciLLus deLbbruecki)。

　　【關(guān)鍵詞】 耐高溫乳酸菌;分離;鑒定

　　乳酸菌(Lactobacillus)是一類能從可發(fā)酵碳水化合物(主要指葡萄糖)產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱[1]。

　　由于乳酸菌具有糖利用率高、發(fā)酵液中純度高、副產(chǎn)物少，使其在乳酸工業(yè)中占有重要地位[2]。

　　乳酸菌在食品發(fā)酵、青貯飼料、堆肥生產(chǎn)、醫(yī)藥行業(yè)等眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用研究[3，4]，而在眾多固態(tài)發(fā)酵領(lǐng)域中一個(gè)難以解決的問題是固態(tài)發(fā)酵中高溫迅速產(chǎn)生對(duì)乳酸菌的殺滅作用，因而選育耐高溫菌株具有極為重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景。

　　本研究從青貯飼料、果渣、泡菜、牛奶中分離高溫乳酸菌，并對(duì)其發(fā)酵條件的優(yōu)化進(jìn)行了初步研究。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　乳酸菌：從上海光明乳業(yè)金山牧場(chǎng)提供的青貯玉米飼料、陜西海盛果汁廠提供的果渣、山東牟平安得利果汁廠提供的果渣、西安農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)得的新鮮泡菜汁、上海光明乳業(yè)提供的牛奶中進(jìn)行分離，將收集的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　標(biāo)準(zhǔn)菌株：德氏乳桿菌(Lactobacillus delbbruecki) JCM 1022、嗜酸乳桿菌(Lacidophilus) ATCC 3456、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)IFO 13957,由陜西微生物研究所提供。

　　培養(yǎng)基: 玉米粉麩皮發(fā)酵培養(yǎng)基、生化鑒定培養(yǎng)基。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 乳酸菌的分離、篩選： 固體樣品青貯玉米飼料、果渣等5 g放入滅菌研缽研碎后移入其他滅菌容器內(nèi)，加500 mL無菌生理鹽水稀釋，振蕩5 min，充分混勻;液體樣品牛乳取1 mL移入9 mL的滅菌生理鹽水的試管中，搖勻;對(duì)新鮮的泡菜汁取1 mL移入9 mL無菌水中，搖勻;然后將上述樣品按照 10倍稀釋法稀釋至10-5、10-6、10-7，用移液槍分別移取0.1 mL到0.5% CaCO3的MRS培養(yǎng)基并加焦性沒食子酸的厭氧培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h～48 h，形成菌落后觀察其形態(tài)，挑取周圍有溶鈣圈的菌落。

　　在MRS平板上反復(fù)劃線直到得到單菌落;將上述分離的乳酸菌進(jìn)行革蘭氏染色形態(tài)觀察，淘汰革蘭氏染色陰性的菌株，保留革蘭氏染色陽(yáng)性的菌株;同時(shí)做接觸酶試驗(yàn)，最后保留接觸酶試驗(yàn)陰性的菌株。

　　綜上結(jié)果，將菌落周圍有溶鈣圈、革蘭氏染色陽(yáng)性、接觸酶試驗(yàn)陰性的菌株暫定為乳酸菌，最后將其分別轉(zhuǎn)移至MRS斜面培養(yǎng)基上，做好標(biāo)記，于4 ℃條件下保藏。

　　1.2.2 乳酸菌復(fù)篩：(1)最適生長(zhǎng)溫度的測(cè)定：將待測(cè)菌株活化后分別置于溫度為50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后測(cè)其總菌數(shù)。

　　(2)最適酸堿度的測(cè)定：將上述耐溫能力強(qiáng)且菌數(shù)量較多的菌株放在適中的溫度下培養(yǎng)，測(cè)其在不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)液pH值的變化情況。

　　1.2.3 耐高溫乳酸菌的鑒定： 用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行乳酸菌的形態(tài)學(xué)鑒定; 參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行生理生化特性鑒定[4]。

　　2 結(jié)果

　　2.1 分離到的菌株

　　從不同地區(qū)采集的樣品中共分離到有溶鈣圈較大的、革蘭氏陽(yáng)性的、接觸酶試驗(yàn)陰性的菌株共6株，顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，其中球菌3株，桿菌3株，分別對(duì)其進(jìn)行編號(hào)，球菌記為R，桿菌為L(zhǎng)。

　　2.2 優(yōu)良菌株篩選結(jié)果

　　2.2.1 耐溫能力篩選：6株菌的耐溫能力見表1。

　　由表1得出：在各溫度條件下，菌株L1、L2、R1的菌數(shù)量均多于菌株L3、R2、R3的菌數(shù)量，所以選擇菌株L1、L2、R1作下一步的試驗(yàn)。

　　表1 菌株培養(yǎng)溫度與菌數(shù)的關(guān)系

　　2.2.2 產(chǎn)酸能力篩選：將菌株L1、L2、R1在60 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，測(cè)其在不同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)液pH的變化情況，培養(yǎng)結(jié)果見表2。

　　通過表2可見，三株菌的產(chǎn)酸能力，L1菌株在20 h時(shí)，其pH值就下降到4.1，而其它兩株菌產(chǎn)酸則較慢。

　　表2 菌株培養(yǎng)時(shí)間與pH值的關(guān)系

　　2.3 乳酸菌鑒定

　　2.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定：菌株L1的革蘭氏染色陽(yáng)性，中長(zhǎng)桿狀、單個(gè)或鏈狀;菌落形態(tài)呈灰白色、圓形、邊緣完整、表面光滑、隆起。

　　見圖1。

　　2.3.2 生理生化及糖發(fā)酵試驗(yàn)： 菌株L1的硝酸鹽還原、H2S試驗(yàn)、明膠水解、吲哚反應(yīng)、接觸酶試驗(yàn)及石蕊牛奶試驗(yàn)結(jié)果:除石蕊牛奶試驗(yàn)陽(yáng)性外，其它反應(yīng)均為陰性。

　　菌株L1對(duì)碳水化合物的利用情況:L1 菌株能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、可溶性淀粉產(chǎn)酸，不能利用半乳糖、乳糖、葡萄糖酸鈉、阿拉伯糖、棉籽糖、山梨醇、木糖、核糖、纖維二糖、麥芽糖、肌醇、鼠李糖產(chǎn)酸。

　　根據(jù)以上鑒定結(jié)果，參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》及《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》,菌株L1屬于乳桿菌屬德氏乳桿菌(LacotobaciLLus deLbbruecki)。

　　結(jié)果見表3。

　　表3 菌株L1碳源利用情況 注：表中“+”表示95%以上為陽(yáng)性，“-”表示95%以上為陰性, “-w”弱陰性反應(yīng),“d”未測(cè)定。

　　3 討論

　　本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過初篩及復(fù)篩，證明L1菌株具有耐高溫且產(chǎn)酸量高的特點(diǎn)。

　　對(duì)L1菌株進(jìn)行了常規(guī)鑒定，確定其歸屬為乳桿菌屬德氏乳桿菌，對(duì)于其細(xì)胞壁的組成以及細(xì)菌中細(xì)胞DNA中G+C含量的摩爾分?jǐn)?shù)的測(cè)定，有待進(jìn)一步研究。

　　乳酸菌因可以提高食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，近年來乳酸菌的特殊生理活性和營(yíng)養(yǎng)功能，正日益引起人們的重視。

　　研究表明[6]：乳酸菌能調(diào)節(jié)胃腸道正常菌群、維持微生態(tài)平衡，從而改善胃腸道功能;提高食物消化率和生物效價(jià);降低血清膽固醇，控制內(nèi)毒素;提高機(jī)體免疫力;抑制腸道內(nèi)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)物的產(chǎn)生，制造營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，刺激組織發(fā)育，從而對(duì)機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、生理功能、細(xì)胞感染、藥物效應(yīng)、毒性反應(yīng)、免疫反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、衰老過程和突然的應(yīng)急反應(yīng)等產(chǎn)生作用。

　　由此可見，乳酸菌的生理功能與機(jī)體的生命活動(dòng)息息相關(guān)。

　　可以說，如果乳酸菌停止生長(zhǎng)，人和動(dòng)物就很難健康生存。

　　也正因?yàn)槿绱耍�乳酸菌不僅應(yīng)用于食品工業(yè)中，而且在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域也有著十分廣泛的用途[7]。

　　在眾多發(fā)酵領(lǐng)域中一個(gè)難以解決的問題是發(fā)酵中高溫迅速產(chǎn)生對(duì)乳酸菌的殺滅作用，因此耐高溫乳酸菌的成功選育對(duì)于解決發(fā)酵的難題具有極為重要的理論意義和廣闊的應(yīng)用前景，有待于進(jìn)一步開發(fā)推廣。

　　【參考文獻(xiàn)】

　　[1] 楊郁，張麗靖，天知誠(chéng)吾.耐酸性乳酸菌的篩選及應(yīng)用的初步研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，46(4)：463.

　　[2] GoLueke C G,Lafrenz D,Chaser B,DIAZ L F.Composting Combined Refuse and Sewage SLudge. Compost Sci./Land UtiLiz.,1980,21(5):42～48.

　　[3] 席北斗，劉鴻亮，白慶中，等.堆肥中纖維素和木質(zhì)素的生物降解研究現(xiàn)狀.環(huán)境污染治理技術(shù)與設(shè)備,2002，3(3)：19～23.

　　[4] 凌代文，東秀珠.乳酸菌分類鑒定及試驗(yàn)方法[M].中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999：31～98.

　　[5] 閆波，劉寧.乳酸菌及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用與展望[J].食品開發(fā)與研究，2004，25(4)：22～23.

　　乳酸菌的應(yīng)用與發(fā)展前景【2】

　　[摘要] 通過對(duì)乳酸菌的研究,了解到只有經(jīng)過特殊工藝處理的乳酸菌才能到達(dá)腸道。

　　進(jìn)入腸內(nèi)的乳酸菌,必須具備數(shù)量多、活力強(qiáng)的特性,才能發(fā)揮其生物功效。

　　如何研制出高濃度且活力強(qiáng)的乳酸菌,是當(dāng)今微生物學(xué)家追求的方向。

　　[關(guān)鍵詞] 乳酸菌;乳酸菌制品;應(yīng)用發(fā)展

　　目前,乳酸菌及乳酸菌飲料在中國(guó)市場(chǎng)可謂家喻戶曉,它正以每年25%的速度在增長(zhǎng),據(jù)有關(guān)報(bào)道,中國(guó)的乳酸菌奶飲品的年總產(chǎn)量已經(jīng)突破50萬噸,年產(chǎn)值也超過25億元人民幣。

　　在國(guó)外益生菌產(chǎn)品的發(fā)展也普遍受到重視,像日本市場(chǎng)上各種品牌的益生菌產(chǎn)品滿目皆是,非常吸引消費(fèi)者的注意力。

　　1 乳酸菌分類

　　乳酸菌大體上可分為兩大類。

　　一類是動(dòng)物源乳酸菌,一類是植物源乳酸菌。

　　因?yàn)閯?dòng)物源取自動(dòng)物,因此菌種常處于相對(duì)不穩(wěn)定狀態(tài),其生物功效也較不穩(wěn)定,且在大量食用時(shí),很容易導(dǎo)致人體動(dòng)物蛋白過敏,即排斥反應(yīng)。

　　而植物源乳酸菌,因?yàn)槿∽灾参镆妆蝗梭w認(rèn)可,不論攝取多大量,都不會(huì)產(chǎn)生蛋白排斥反應(yīng),且植物源乳酸菌比動(dòng)物源性更具有活力,能比動(dòng)物源性蛋白以多8倍的數(shù)量到達(dá)人體小腸內(nèi)定植,從而發(fā)揮其強(qiáng)大而穩(wěn)定的生物功效[1]。

　　2 乳酸菌的治療和保健

　　乳酸菌對(duì)人和動(dòng)物都有保健和治療功效,國(guó)內(nèi)、外均有大量動(dòng)物和臨床試驗(yàn)證明,乳酸菌能維持微生態(tài)平衡和腸管機(jī)能,改善肝功能,防治乳糖不耐癥(喝鮮奶時(shí)出現(xiàn)的腹脹、腹瀉等癥狀),還有防癌、抗癌和抗衰老作用。

　　3 乳酸菌的歷史及現(xiàn)狀

　　20世紀(jì),俄國(guó)的生物學(xué)家梅契尼柯夫(Mechnikoff,1845-1916),在他的“長(zhǎng)壽學(xué)說”里明確指出,保加利亞的巴爾干島地區(qū)居民,日常生活中經(jīng)常飲用的酸奶中含有大量的乳酸菌,這些乳酸菌能夠定植在人體內(nèi),有效地抑制有害菌的生長(zhǎng),減少由于腸道內(nèi)有害菌產(chǎn)生的毒素對(duì)整個(gè)機(jī)體的毒害,這是保加利亞地區(qū)居民長(zhǎng)壽的重要原因。

　　這個(gè)“長(zhǎng)壽學(xué)說”具有劃時(shí)代意義。

　　今天,乳酸菌及其飲品已在許多國(guó)家相當(dāng)普及[2]。

　　早在5 000年前人類就已經(jīng)在使用乳酸菌。

　　人們?cè)谡J(rèn)識(shí)乳酸菌之前就已利用它們來加工和保存食品,幫助調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡,促進(jìn)排出毒素,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)有效吸收。

　　乳酸菌不僅可以提高食品保藏性和附加值,而且有其特定生理活性和保健功能。

　　4 乳酸菌的發(fā)展前景

　　有專家報(bào)道人體腸道內(nèi)乳酸菌擁有的數(shù)量,隨著人的年齡增長(zhǎng)會(huì)逐漸減少,不健康的飲食習(xí)慣、攝入低纖維的食物、每天的壓力都會(huì)對(duì)腸胃健康造成不良的影響。

　　通過乳酸菌清除腸道垃圾能使人們的生活更加健康。

　　當(dāng)前,由于抗生素的大量使用,使人體腸道內(nèi)以乳酸菌為主的正常菌群已遭到嚴(yán)重的破壞,人的抵抗力越來越低,人類的健康正面臨嚴(yán)重的危脅。

　　人們正在不斷尋求新的更加有效的抗菌產(chǎn)品,世界上發(fā)達(dá)國(guó)家已經(jīng)認(rèn)識(shí)到并開始了以使用乳酸菌為代表的免疫療法革命。

　　其實(shí)普通的乳酸菌,活力極弱,它們只能在相對(duì)受限制的環(huán)境中存活,一旦脫離開這些環(huán)境,其自身也會(huì)遭到滅亡。

　　只有經(jīng)過特殊工藝處理的乳酸菌才能到達(dá)腸道。

　　進(jìn)入腸道內(nèi)的乳酸菌,必須具備數(shù)量多、活力強(qiáng)的特性,才能發(fā)揮其生物功效[3]。

　　如何研制出高濃度且活力強(qiáng)的乳酸菌,成為了當(dāng)今微生物學(xué)家們追求的夢(mèng)想。

　　據(jù)中國(guó)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會(huì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示,20世紀(jì)初乳酸菌奶飲料行業(yè)在我國(guó)乳制品行業(yè)的市場(chǎng)份額不足0.1%,到2005年就超過了3.0%。

　　然而一些發(fā)達(dá)國(guó)家的乳酸菌奶類產(chǎn)品,已占到乳品市場(chǎng)的80.0%,世界乳酸菌奶飲品平均市場(chǎng)占有率已達(dá)30.0%。

　　以乳酸菌飲料為代表的乳酸菌應(yīng)用產(chǎn)業(yè)開始走紅,已成為業(yè)內(nèi)外的投資熱點(diǎn)。

　　要有高質(zhì)量的產(chǎn)品,必須健全產(chǎn)品的質(zhì)量,便于生產(chǎn),也便于管理。

　　醫(yī)藥保健品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)引起國(guó)家有關(guān)部門的關(guān)注。

　　標(biāo)準(zhǔn)不健全很難與國(guó)際接軌。

　　要使乳酸菌及其產(chǎn)業(yè)在中國(guó)穩(wěn)健地發(fā)展,并給消費(fèi)者帶來真正的健康,就要有規(guī)范的東西,那就是標(biāo)準(zhǔn)。

　　老百姓知道如何消費(fèi),企業(yè)知道如何生產(chǎn),也便于政府管理。

　　這樣,乳酸菌制品及乳酸菌的產(chǎn)業(yè)在中國(guó)將越走越遠(yuǎn),發(fā)展會(huì)越來越健康。

　　[參考文獻(xiàn)]

　　[1]黃君紅,彭麗珍,王愛蘭.酸奶中乳酸菌含量的檢測(cè)[J].中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志, 2001,13(6):18-19.

　　[2]徐筠.話說酸奶[J].健康,2005,(4):34.

　　[3]霍貴成.乳酸菌的研究與應(yīng)用[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2007:163.

　　貴州少數(shù)民族酸肉、酸魚中乳酸菌的分離鑒定【3】

　　摘要：采用傳統(tǒng)微生物分離方法進(jìn)行乳酸菌純種分離，利用16S rRNA序列分析方法進(jìn)行乳酸菌鑒定，從7個(gè)酸肉、酸魚樣品中共分離出14株乳酸菌，有乳桿菌屬、環(huán)絲菌屬、乳球菌屬3個(gè)屬，9個(gè)種。

　　從其中鑒定出7株乳酸菌，分別是：植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、消化乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)、泡菜乳桿菌(Lactobacillus kimchi)、清酒乳桿菌亞種(肉)(Lactobacillus sakei subsp. carnosus)、草乳桿菌(Lactobacillus graminis)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)。

　　關(guān)鍵詞：酸魚;酸肉;乳酸菌;分離鑒定

　　貴州黔東南苗族、侗族自治州傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉/魚制品主要是以豬肉和魚肉為原料，洗凈后加入一定量的鹽腌制2～3d，再根據(jù)當(dāng)?shù)氐娘嬍沉?xí)慣多加甜酒、熟糯米、生姜、花椒、辣椒粉、大蒜等輔料，裝入壇、瓦缸、木桶等容器中，上層用葉片、塑料和水來隔絕空氣，放置于避光陰涼地方自然發(fā)酵。

　　此方法是當(dāng)?shù)鼐用裱永m(xù)祖先智慧結(jié)晶一代一代傳承下來的，具有歷史悠久、風(fēng)味獨(dú)特、安全和綠色的特點(diǎn)。

　　但由于傳統(tǒng)手工工藝制作，發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)，沒有大規(guī)模的生產(chǎn)和市場(chǎng)上流通，其他地域的人們無法享受這種風(fēng)味獨(dú)特的發(fā)酵肉制品[1-3]。

　　乳酸菌是發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)菌群，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)變化起著至關(guān)重要的作用[4-7]。

　　目前，對(duì)于貴州傳統(tǒng)少數(shù)民族發(fā)酵肉制品中乳酸菌的研究還相當(dāng)缺乏[8]。

　　因此，本研究以貴州少數(shù)民族地區(qū)侗族發(fā)酵酸肉和苗族發(fā)酵酸魚為材料，采用傳統(tǒng)微生物分離方法進(jìn)行乳酸菌純種分離，利用16S rRNA序列分析方法進(jìn)行乳酸菌鑒定[9-12]，旨在從原生態(tài)食品中發(fā)掘有益乳酸菌，以利于進(jìn)一步研究乳酸菌的發(fā)酵特性、改進(jìn)傳統(tǒng)工藝，為保護(hù)、利用本土原生態(tài)的微生物資源打下基礎(chǔ)。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　實(shí)驗(yàn)原料來自于貴州省黔東南州從江縣及黎平縣農(nóng)戶家純手工制作的酸肉、酸魚，共7個(gè)樣品，其中酸肉4個(gè)樣品，酸魚3個(gè)樣品，采樣時(shí)嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)GB/T4789.1―2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)：食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》操作。

　　酸肉、酸魚樣品分別編號(hào)如表1所示。

　　1.1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

　　培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基、PY培養(yǎng)基、PYG液體培養(yǎng)基(在PY培養(yǎng)基中添加10g/L葡萄糖)。

　　主要試劑：革蘭氏染色試劑、細(xì)菌微量生化鑒定管(麥芽糖、乳糖、葡萄糖)、試劑A(α-萘酚5g和95%體積分?jǐn)?shù)乙醇100mL)、試劑B(KOH 80g、肌酸(Creatine)0.6g、蒸餾水200mL)、溶菌酶、CTAB(十六烷基三甲溴化胺)裂解液、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇、聚乙二醇均為分析純。

　　1.2 儀器與設(shè)備

　　CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡 奧林巴斯(中國(guó))有限公司;S1000TM Thermal Cycler PCR儀、DcodeTM Universal Mutation Detection System DGGE電泳儀、Gel DocXR凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;Gilson P型移液器 法國(guó)吉爾森公司;Micro 17R微量高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Electron公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 菌株分離純化

　　取3g樣品，剪碎放入MRS液體培養(yǎng)基中， 36℃恒溫厭氧培養(yǎng)48h，然后稀釋5個(gè)梯度(10-1～10-5)后，直接涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，36℃恒溫厭氧培養(yǎng)48h。

　　再采用平板劃線法對(duì)涂布平板中不同的單個(gè)菌落進(jìn)行接種、培養(yǎng)，并進(jìn)行革蘭氏染色和鏡檢，重復(fù)分離純化直至鏡檢結(jié)果一致。

　　1.3.2 菌株分類鑒定方法

　　1.3.2.1 菌落特征

　　對(duì)純化菌株在MRS固體培養(yǎng)基上的菌落特征進(jìn)行觀察、記錄和編號(hào)，主要包括菌落大小、形狀、顏色、濕潤(rùn)度、光澤度、透明度、隆起形狀、邊緣特征等。

　　將初步認(rèn)定為乳酸菌菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

　　1.3.2.2 菌種分類生理生化試驗(yàn)

　　主要生理生化試驗(yàn)包括：接觸酶試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇(voges-proskauer，VP)試驗(yàn)、石蕊牛奶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、葡萄糖產(chǎn)酸試驗(yàn)和糖發(fā)酵試驗(yàn)[13-15]。

　　1.3.3 菌株DNA的提取

　　參照譚映月等[16]提取DNA方法，有所改動(dòng)。

　　取備用菌株菌液2mL于2mL離心管中，8000×g離心8min，收集沉淀;加200μL溶菌酶(質(zhì)量濃度為0.05g/mL)，置于35℃水浴2h;加2%十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)裂解液0.5mL，上下顛倒混勻10min;加0.5mL Tris-飽和酚：氯仿：異戊醇=25：24：1，上下顛倒混勻2min后，于10000×g離心5min;收集上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入等體積的氯仿：異戊醇=24：1。

　　上下顛倒混勻2min后于10000×g離心5min;收集上清液轉(zhuǎn)入新的離心管，加入2倍體積30%聚乙二醇于4℃條件下沉淀4h;取出離心管于14000×g離心8min，倒掉上清液，用70%體積分?jǐn)?shù)乙醇洗滌DNA 3次，經(jīng)真空干燥后轉(zhuǎn)入0.2mL PCR管，加50mL TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)緩沖液于20℃保存。

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