耐高溫乳酸菌的分離與鑒定

　　耐高溫乳酸菌的分離與鑒定【1】

　　【摘要】 目的：本實驗從不同地方采集的青貯玉米飼料、果渣、牛奶、新鮮的泡菜汁等樣品中篩選耐高溫乳酸菌。

　　方法：通過初篩、復篩，獲得一株耐高溫且產酸能力較強的菌株L1;依據伯杰氏系統細菌學手冊和乳酸菌分類鑒定的標準和描述，對其進行了生理生化特性鑒定;通過單因素試驗和正交試驗確定菌株L1的最佳發酵條件。

　　結果：確定其為乳桿菌屬德氏乳桿菌;最佳增殖培養基組分為：玉米粉16%+麩皮5%;在α-淀粉酶(5 U/g玉米粉、90 ℃、30 min)和糖化酶(150 U/g玉米粉、55 ℃、2 h～3 h)酶解作用下，最佳發酵條件為：發酵溫度60 ℃，發酵時間36 h，pH值3.5。

　　結論：經過初篩、復篩獲得一株耐高溫菌株L1，通過糖發酵等生理生化試驗、正交試驗鑒定，最后確定此菌株為乳桿菌屬德氏乳桿菌(LacotobaciLLus deLbbruecki)。

　　【關鍵詞】 耐高溫乳酸菌;分離;鑒定

　　乳酸菌(Lactobacillus)是一類能從可發酵碳水化合物(主要指葡萄糖)產生大量乳酸的細菌的統稱[1]。

　　由于乳酸菌具有糖利用率高、發酵液中純度高、副產物少，使其在乳酸工業中占有重要地位[2]。

　　乳酸菌在食品發酵、青貯飼料、堆肥生產、醫藥行業等眾多領域有著廣泛的應用研究[3，4]，而在眾多固態發酵領域中一個難以解決的問題是固態發酵中高溫迅速產生對乳酸菌的殺滅作用，因而選育耐高溫菌株具有極為重要的理論意義和廣闊的應用前景。

　　本研究從青貯飼料、果渣、泡菜、牛奶中分離高溫乳酸菌，并對其發酵條件的優化進行了初步研究。

　　1 材料與方法

　　1.1 實驗材料

　　乳酸菌：從上海光明乳業金山牧場提供的青貯玉米飼料、陜西海盛果汁廠提供的果渣、山東牟平安得利果汁廠提供的果渣、西安農貿市場購得的新鮮泡菜汁、上海光明乳業提供的牛奶中進行分離，將收集的樣品帶回實驗室置于4 ℃冰箱保存備用。

　　標準菌株：德氏乳桿菌(Lactobacillus delbbruecki) JCM 1022、嗜酸乳桿菌(Lacidophilus) ATCC 3456、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)IFO 13957,由陜西微生物研究所提供。

　　培養基: 玉米粉麩皮發酵培養基、生化鑒定培養基。

　　1.2 實驗方法

　　1.2.1 乳酸菌的分離、篩選： 固體樣品青貯玉米飼料、果渣等5 g放入滅菌研缽研碎后移入其他滅菌容器內，加500 mL無菌生理鹽水稀釋，振蕩5 min，充分混勻;液體樣品牛乳取1 mL移入9 mL的滅菌生理鹽水的試管中，搖勻;對新鮮的泡菜汁取1 mL移入9 mL無菌水中，搖勻;然后將上述樣品按照 10倍稀釋法稀釋至10-5、10-6、10-7，用移液槍分別移取0.1 mL到0.5% CaCO3的MRS培養基并加焦性沒食子酸的厭氧培養基上，37 ℃培養24 h～48 h，形成菌落后觀察其形態，挑取周圍有溶鈣圈的菌落。

　　在MRS平板上反復劃線直到得到單菌落;將上述分離的乳酸菌進行革蘭氏染色形態觀察，淘汰革蘭氏染色陰性的菌株，保留革蘭氏染色陽性的菌株;同時做接觸酶試驗，最后保留接觸酶試驗陰性的菌株。

　　綜上結果，將菌落周圍有溶鈣圈、革蘭氏染色陽性、接觸酶試驗陰性的菌株暫定為乳酸菌，最后將其分別轉移至MRS斜面培養基上，做好標記，于4 ℃條件下保藏。

　　1.2.2 乳酸菌復篩：(1)最適生長溫度的測定：將待測菌株活化后分別置于溫度為50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃的恒溫箱中培養，培養24 h后測其總菌數。

　　(2)最適酸堿度的測定：將上述耐溫能力強且菌數量較多的菌株放在適中的溫度下培養，測其在不同培養時間培養液pH值的變化情況。

　　1.2.3 耐高溫乳酸菌的鑒定： 用光學顯微鏡進行乳酸菌的形態學鑒定; 參照伯杰氏細菌鑒定手冊及《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》進行生理生化特性鑒定[4]。

　　2 結果

　　2.1 分離到的菌株

　　從不同地區采集的樣品中共分離到有溶鈣圈較大的、革蘭氏陽性的、接觸酶試驗陰性的菌株共6株，顯微鏡下觀察菌體形態，其中球菌3株，桿菌3株，分別對其進行編號，球菌記為R，桿菌為L。

　　2.2 優良菌株篩選結果

　　2.2.1 耐溫能力篩選：6株菌的耐溫能力見表1。

　　由表1得出：在各溫度條件下，菌株L1、L2、R1的菌數量均多于菌株L3、R2、R3的菌數量，所以選擇菌株L1、L2、R1作下一步的試驗。

　　表1 菌株培養溫度與菌數的關系

　　2.2.2 產酸能力篩選：將菌株L1、L2、R1在60 ℃恒溫箱中培養，測其在不同培養時間培養液pH的變化情況，培養結果見表2。

　　通過表2可見，三株菌的產酸能力，L1菌株在20 h時，其pH值就下降到4.1，而其它兩株菌產酸則較慢。

　　表2 菌株培養時間與pH值的關系

　　2.3 乳酸菌鑒定

　　2.3.1 形態學鑒定：菌株L1的革蘭氏染色陽性，中長桿狀、單個或鏈狀;菌落形態呈灰白色、圓形、邊緣完整、表面光滑、隆起。

　　見圖1。

　　2.3.2 生理生化及糖發酵試驗： 菌株L1的硝酸鹽還原、H2S試驗、明膠水解、吲哚反應、接觸酶試驗及石蕊牛奶試驗結果:除石蕊牛奶試驗陽性外，其它反應均為陰性。

　　菌株L1對碳水化合物的利用情況:L1 菌株能利用葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、可溶性淀粉產酸，不能利用半乳糖、乳糖、葡萄糖酸鈉、阿拉伯糖、棉籽糖、山梨醇、木糖、核糖、纖維二糖、麥芽糖、肌醇、鼠李糖產酸。

　　根據以上鑒定結果，參照《伯杰細菌鑒定手冊》及《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》,菌株L1屬于乳桿菌屬德氏乳桿菌(LacotobaciLLus deLbbruecki)。

　　結果見表3。

　　表3 菌株L1碳源利用情況 注：表中“+”表示95%以上為陽性，“-”表示95%以上為陰性, “-w”弱陰性反應,“d”未測定。

　　3 討論

　　本實驗經過初篩及復篩，證明L1菌株具有耐高溫且產酸量高的特點。

　　對L1菌株進行了常規鑒定，確定其歸屬為乳桿菌屬德氏乳桿菌，對于其細胞壁的組成以及細菌中細胞DNA中G+C含量的摩爾分數的測定，有待進一步研究。

　　乳酸菌因可以提高食品的營養價值，近年來乳酸菌的特殊生理活性和營養功能，正日益引起人們的重視。

　　研究表明[6]：乳酸菌能調節胃腸道正常菌群、維持微生態平衡，從而改善胃腸道功能;提高食物消化率和生物效價;降低血清膽固醇，控制內毒素;提高機體免疫力;抑制腸道內菌生長和產物的產生，制造營養物質，刺激組織發育，從而對機體的營養狀態、生理功能、細胞感染、藥物效應、毒性反應、免疫反應、腫瘤發生、衰老過程和突然的應急反應等產生作用。

　　由此可見，乳酸菌的生理功能與機體的生命活動息息相關。

　　可以說，如果乳酸菌停止生長，人和動物就很難健康生存。

　　也正因為如此，乳酸菌不僅應用于食品工業中，而且在工業、農業、醫藥衛生等領域也有著十分廣泛的用途[7]。

　　在眾多發酵領域中一個難以解決的問題是發酵中高溫迅速產生對乳酸菌的殺滅作用，因此耐高溫乳酸菌的成功選育對于解決發酵的難題具有極為重要的理論意義和廣闊的應用前景，有待于進一步開發推廣。

　　【參考文獻】

　　[1] 楊郁，張麗靖，天知誠吾.耐酸性乳酸菌的篩選及應用的初步研究[J].浙江農業科學，2006，46(4)：463.

　　[2] GoLueke C G,Lafrenz D,Chaser B,DIAZ L F.Composting Combined Refuse and Sewage SLudge. Compost Sci./Land UtiLiz.,1980,21(5):42～48.

　　[3] 席北斗，劉鴻亮，白慶中，等.堆肥中纖維素和木質素的生物降解研究現狀.環境污染治理技術與設備,2002，3(3)：19～23.

　　[4] 凌代文，東秀珠.乳酸菌分類鑒定及試驗方法[M].中國輕工業出版社，1999：31～98.

　　[5] 閆波，劉寧.乳酸菌及其在食品工業中的應用與展望[J].食品開發與研究，2004，25(4)：22～23.

　　乳酸菌的應用與發展前景【2】

　　[摘要] 通過對乳酸菌的研究,了解到只有經過特殊工藝處理的乳酸菌才能到達腸道。

　　進入腸內的乳酸菌,必須具備數量多、活力強的特性,才能發揮其生物功效。

　　如何研制出高濃度且活力強的乳酸菌,是當今微生物學家追求的方向。

　　[關鍵詞] 乳酸菌;乳酸菌制品;應用發展

　　目前,乳酸菌及乳酸菌飲料在中國市場可謂家喻戶曉,它正以每年25%的速度在增長,據有關報道,中國的乳酸菌奶飲品的年總產量已經突破50萬噸,年產值也超過25億元人民幣。

　　在國外益生菌產品的發展也普遍受到重視,像日本市場上各種品牌的益生菌產品滿目皆是,非常吸引消費者的注意力。

　　1 乳酸菌分類

　　乳酸菌大體上可分為兩大類。

　　一類是動物源乳酸菌,一類是植物源乳酸菌。

　　因為動物源取自動物,因此菌種常處于相對不穩定狀態,其生物功效也較不穩定,且在大量食用時,很容易導致人體動物蛋白過敏,即排斥反應。

　　而植物源乳酸菌,因為取自植物易被人體認可,不論攝取多大量,都不會產生蛋白排斥反應,且植物源乳酸菌比動物源性更具有活力,能比動物源性蛋白以多8倍的數量到達人體小腸內定植,從而發揮其強大而穩定的生物功效[1]。

　　2 乳酸菌的治療和保健

　　乳酸菌對人和動物都有保健和治療功效,國內、外均有大量動物和臨床試驗證明,乳酸菌能維持微生態平衡和腸管機能,改善肝功能,防治乳糖不耐癥(喝鮮奶時出現的腹脹、腹瀉等癥狀),還有防癌、抗癌和抗衰老作用。

　　3 乳酸菌的歷史及現狀

　　20世紀,俄國的生物學家梅契尼柯夫(Mechnikoff,1845-1916),在他的“長壽學說”里明確指出,保加利亞的巴爾干島地區居民,日常生活中經常飲用的酸奶中含有大量的乳酸菌,這些乳酸菌能夠定植在人體內,有效地抑制有害菌的生長,減少由于腸道內有害菌產生的毒素對整個機體的毒害,這是保加利亞地區居民長壽的重要原因。

　　這個“長壽學說”具有劃時代意義。

　　今天,乳酸菌及其飲品已在許多國家相當普及[2]。

　　早在5 000年前人類就已經在使用乳酸菌。

　　人們在認識乳酸菌之前就已利用它們來加工和保存食品,幫助調節腸道微生態平衡,促進排出毒素,促進營養有效吸收。

　　乳酸菌不僅可以提高食品保藏性和附加值,而且有其特定生理活性和保健功能。

　　4 乳酸菌的發展前景

　　有專家報道人體腸道內乳酸菌擁有的數量,隨著人的年齡增長會逐漸減少,不健康的飲食習慣、攝入低纖維的食物、每天的壓力都會對腸胃健康造成不良的影響。

　　通過乳酸菌清除腸道垃圾能使人們的生活更加健康。

　　當前,由于抗生素的大量使用,使人體腸道內以乳酸菌為主的正常菌群已遭到嚴重的破壞,人的抵抗力越來越低,人類的健康正面臨嚴重的危脅。

　　人們正在不斷尋求新的更加有效的抗菌產品,世界上發達國家已經認識到并開始了以使用乳酸菌為代表的免疫療法革命。

　　其實普通的乳酸菌,活力極弱,它們只能在相對受限制的環境中存活,一旦脫離開這些環境,其自身也會遭到滅亡。

　　只有經過特殊工藝處理的乳酸菌才能到達腸道。

　　進入腸道內的乳酸菌,必須具備數量多、活力強的特性,才能發揮其生物功效[3]。

　　如何研制出高濃度且活力強的乳酸菌,成為了當今微生物學家們追求的夢想。

　　據中國食品科學技術學會數據統計顯示,20世紀初乳酸菌奶飲料行業在我國乳制品行業的市場份額不足0.1%,到2005年就超過了3.0%。

　　然而一些發達國家的乳酸菌奶類產品,已占到乳品市場的80.0%,世界乳酸菌奶飲品平均市場占有率已達30.0%。

　　以乳酸菌飲料為代表的乳酸菌應用產業開始走紅,已成為業內外的投資熱點。

　　要有高質量的產品,必須健全產品的質量,便于生產,也便于管理。

　　醫藥保健品質量標準已經引起國家有關部門的關注。

　　標準不健全很難與國際接軌。

　　要使乳酸菌及其產業在中國穩健地發展,并給消費者帶來真正的健康,就要有規范的東西,那就是標準。

　　老百姓知道如何消費,企業知道如何生產,也便于政府管理。

　　這樣,乳酸菌制品及乳酸菌的產業在中國將越走越遠,發展會越來越健康。

　　[參考文獻]

　　[1]黃君紅,彭麗珍,王愛蘭.酸奶中乳酸菌含量的檢測[J].中國微生態學雜志, 2001,13(6):18-19.

　　[2]徐筠.話說酸奶[J].健康,2005,(4):34.

　　[3]霍貴成.乳酸菌的研究與應用[M].北京:中國輕工業出版社,2007:163.

　　貴州少數民族酸肉、酸魚中乳酸菌的分離鑒定【3】

　　摘要：采用傳統微生物分離方法進行乳酸菌純種分離，利用16S rRNA序列分析方法進行乳酸菌鑒定，從7個酸肉、酸魚樣品中共分離出14株乳酸菌，有乳桿菌屬、環絲菌屬、乳球菌屬3個屬，9個種。

　　從其中鑒定出7株乳酸菌，分別是：植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、消化乳桿菌(Lactobacillus alimentarius)、清酒乳桿菌(Lactobacillus sakei)、泡菜乳桿菌(Lactobacillus kimchi)、清酒乳桿菌亞種(肉)(Lactobacillus sakei subsp. carnosus)、草乳桿菌(Lactobacillus graminis)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)。

　　關鍵詞：酸魚;酸肉;乳酸菌;分離鑒定

　　貴州黔東南苗族、侗族自治州傳統發酵酸肉/魚制品主要是以豬肉和魚肉為原料，洗凈后加入一定量的鹽腌制2～3d，再根據當地的飲食習慣多加甜酒、熟糯米、生姜、花椒、辣椒粉、大蒜等輔料，裝入壇、瓦缸、木桶等容器中，上層用葉片、塑料和水來隔絕空氣，放置于避光陰涼地方自然發酵。

　　此方法是當地居民延續祖先智慧結晶一代一代傳承下來的，具有歷史悠久、風味獨特、安全和綠色的特點。

　　但由于傳統手工工藝制作，發酵時間長，沒有大規模的生產和市場上流通，其他地域的人們無法享受這種風味獨特的發酵肉制品[1-3]。

　　乳酸菌是發酵肉制品中的優勢菌群，對發酵產品的風味和營養品質變化起著至關重要的作用[4-7]。

　　目前，對于貴州傳統少數民族發酵肉制品中乳酸菌的研究還相當缺乏[8]。

　　因此，本研究以貴州少數民族地區侗族發酵酸肉和苗族發酵酸魚為材料，采用傳統微生物分離方法進行乳酸菌純種分離，利用16S rRNA序列分析方法進行乳酸菌鑒定[9-12]，旨在從原生態食品中發掘有益乳酸菌，以利于進一步研究乳酸菌的發酵特性、改進傳統工藝，為保護、利用本土原生態的微生物資源打下基礎。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料與試劑

　　1.1.1 實驗材料

　　實驗原料來自于貴州省黔東南州從江縣及黎平縣農戶家純手工制作的酸肉、酸魚，共7個樣品，其中酸肉4個樣品，酸魚3個樣品，采樣時嚴格按照國標GB/T4789.1―2010《食品安全國家標準：食品微生物學檢驗》操作。

　　酸肉、酸魚樣品分別編號如表1所示。

　　1.1.2 培養基及主要試劑

　　培養基：MRS肉湯培養基、PY培養基、PYG液體培養基(在PY培養基中添加10g/L葡萄糖)。

　　主要試劑：革蘭氏染色試劑、細菌微量生化鑒定管(麥芽糖、乳糖、葡萄糖)、試劑A(α-萘酚5g和95%體積分數乙醇100mL)、試劑B(KOH 80g、肌酸(Creatine)0.6g、蒸餾水200mL)、溶菌酶、CTAB(十六烷基三甲溴化胺)裂解液、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇、聚乙二醇均為分析純。

　　1.2 儀器與設備

　　CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡 奧林巴斯(中國)有限公司;S1000TM Thermal Cycler PCR儀、DcodeTM Universal Mutation Detection System DGGE電泳儀、Gel DocXR凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司;Gilson P型移液器 法國吉爾森公司;Micro 17R微量高速冷凍離心機 美國Thermo Electron公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 菌株分離純化

　　取3g樣品，剪碎放入MRS液體培養基中， 36℃恒溫厭氧培養48h，然后稀釋5個梯度(10-1～10-5)后，直接涂布于MRS固體培養基上，36℃恒溫厭氧培養48h。

　　再采用平板劃線法對涂布平板中不同的單個菌落進行接種、培養，并進行革蘭氏染色和鏡檢，重復分離純化直至鏡檢結果一致。

　　1.3.2 菌株分類鑒定方法

　　1.3.2.1 菌落特征

　　對純化菌株在MRS固體培養基上的菌落特征進行觀察、記錄和編號，主要包括菌落大小、形狀、顏色、濕潤度、光澤度、透明度、隆起形狀、邊緣特征等。

　　將初步認定為乳酸菌菌株進行革蘭氏染色鏡檢。

　　1.3.2.2 菌種分類生理生化試驗

　　主要生理生化試驗包括：接觸酶試驗、甲基紅試驗、乙酰甲基甲醇(voges-proskauer，VP)試驗、石蕊牛奶試驗、淀粉水解試驗、葡萄糖產酸試驗和糖發酵試驗[13-15]。

　　1.3.3 菌株DNA的提取

　　參照譚映月等[16]提取DNA方法，有所改動。

　　取備用菌株菌液2mL于2mL離心管中，8000×g離心8min，收集沉淀;加200μL溶菌酶(質量濃度為0.05g/mL)，置于35℃水浴2h;加2%十六烷基三甲基溴化銨(Hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)裂解液0.5mL，上下顛倒混勻10min;加0.5mL Tris-飽和酚：氯仿：異戊醇=25：24：1，上下顛倒混勻2min后，于10000×g離心5min;收集上清液轉入新的離心管，加入等體積的氯仿：異戊醇=24：1。

　　上下顛倒混勻2min后于10000×g離心5min;收集上清液轉入新的離心管，加入2倍體積30%聚乙二醇于4℃條件下沉淀4h;取出離心管于14000×g離心8min，倒掉上清液，用70%體積分數乙醇洗滌DNA 3次，經真空干燥后轉入0.2mL PCR管，加50mL TE(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0)緩沖液于20℃保存。

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