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葉下珠復方Ⅱ號對小鼠實驗性肝損傷的保護作用
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【摘要】 觀察葉下珠復方Ⅱ號對小鼠實驗性肝損傷的保護作用。【方法】將NIH小鼠隨機分成正常對照組，模型組，葉下珠復方Ⅱ號高、中、低劑量組(劑量分別為110、55、27.5g·kg-1)，聯苯雙酯組(150mg·kg-1);以刀豆蛋白A(Con A)和D?氨基半乳糖(D?GalN)分別復制小鼠急性肝損傷模型，用葉下珠復方II號水提液進行干預治療，并與聯苯雙酯進行對照，檢測小鼠血清谷丙轉氨酶( ALT)、谷草轉氨酶(AST)及肝組織超氧化物歧化酶(SOD)活性，并觀察肝組織病理改變。【結果】葉下珠復方Ⅱ號可顯著性降低兩種實驗性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性，升高肝損傷小鼠肝組織SOD活性，與模型組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，與聯苯雙酯組比較差異無顯著性意義(P>0.05)，且可明顯減輕肝組織病理改變。 【結論】 葉下珠復方Ⅱ號對刀豆蛋白A和D?氨基半乳糖所致小鼠實驗性肝損傷具有較好的保護作用，作用機制與抑制脂質過氧化損傷有關。
【關鍵詞】 葉下珠復方Ⅱ號/藥理學 肝損傷/中藥療法 肝/病理學 疾病模型 動物 小鼠
葉下珠復方Ⅱ號是在葉下珠復方[1]的基礎上加入桃仁、苦參等藥物組方而成，具有解毒活血、疏肝健脾作用，臨床上主要用于慢性乙型肝炎和肝纖維化的治療。為探討該復方對實驗性肝損傷保護作用的效果，我們以NIH小鼠為實驗對象，觀察該方對刀豆蛋白A(Con A)所致免疫性肝損傷模型和D?氨基半乳糖(D?GalN)所致化學性肝損傷模型的作用，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 動物 NIH小鼠，雌雄各半，體質量18～22g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(粵)2003-0001。
1.2 藥物 葉下珠復方Ⅱ號組方藥材購于廣州中醫藥大學第一附屬醫院，水煎2次，混合后濃縮成含生藥4kg/L，用時以蒸餾水配成所需濃度;聯苯雙酯滴丸由北京協和制藥廠生產，批號04060106，每丸含聯苯雙酯7.5mg，試驗時以30g/L的二甲基亞砜溶解，再用蒸餾水稀釋至所需濃度;刀豆蛋白A(Con A)為美國華盛頓生物藥品公司產品;D?氨基半乳糖(D?GalN)由重慶醫科大學生化教研室生產，批號050326。
1.3 主要試劑與儀器 谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)檢測試劑盒均由上海榮盛生物技術有限公司提供，批號為20050125;超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號20041108;722型分光光度計(上海第三分析儀器廠);TLL?C臺式冷凍離心機(北京四環科學儀器廠); CK40?F200型顯微鏡(Olympus Optical Co.Ltd)。
1.4 ConA致小鼠急性肝損傷模型復制及分組、給藥方法[2] 將60只NIH小鼠隨機分為6組，每組10只，分別為正常對照組，模型組，葉下珠復方Ⅱ號高、中、低劑量組(簡稱中藥高、中、低劑量組，劑量分別為110、55、27.5g·kg-1，相當于20倍、10倍和5倍臨床用藥劑量)，聯苯雙酯(150mg·kg-1)治療組。除正常對照組外，其他各組小鼠于實驗首日上午尾靜脈注射ConA20mg·kg-1，各給藥組于首日、次日和第3日上午予小鼠灌胃給藥1次;末次給藥后4h，模型組和各給藥組小鼠再次尾靜脈注射ConA20mg·kg-1，禁食不禁水，8h后摘眼球取血，分離血清待檢;斷頭處死動物，取肝左葉組織，一部分用體積分數為40%甲醛溶液固定，另一部分制成勻漿待檢。
1.5 D?GalN致小鼠急性肝損傷模型的復制及分組、給藥方法[3] 分組和劑量設計同1.4，各治療組小鼠每日灌胃給藥1次，連續4d。末次給藥后1h，除正常對照組外，其他組小鼠均以D?GalN 800mg·kg-1腹腔注射，禁食不禁水，24h后摘眼球取血，分離血清待檢;斷頭處死動物，取肝左葉組織，一部分用體積分數為40%甲醛溶液固定，另一部分制成勻漿待檢。
1.6 血漿ALT、AST活性檢測 采用賴氏法，按試劑盒說明操作，采用722型紫外分光光度計于波長505nm處檢測吸光值,制定標準曲線,換算成ALT、AST值。
1.7 肝組織SOD活性測定 將肝組織制成100g/L勻漿，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，按試劑盒說明操作。
1.8 組織病理學觀察 以體積分數為40%甲醛溶液固定肝組織, 石蠟包埋切片，常規蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察、拍照。
1.9 統計學方法 采用SPSS10.0軟件包進行統計分析,多組計量資料分析采用One?way ANOVA法,多重比較采用LSD法。
2 結果
2.1 葉下珠復方Ⅱ號對Con A致小鼠急性肝損傷模型的保護作用 由表1可知，模型組小鼠血清ALT、AST活性較正常對照組升高，肝組織SOD活性較正常對照組降低，差異均有顯著性意義(P<0.01)。中藥高、中、低劑量組ALT、AST活性均低于模型組，差異有顯著性意義(P<0.01)，而與聯苯雙酯組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。中藥高、中、低劑量組肝組織中SOD的活性高于模型組，差異有顯著性意義(P <0.01)， 但與聯苯雙酯組比較，差異無顯著性意義(P>0.05)。
肝組織病理學觀察：光鏡下見正常對照組肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝竇未見異常。模型組全部小鼠肝組織均出現明顯病變，小葉內大多數肝細胞腫脹，細胞質疏松化，有的呈氣球樣變，可見凋亡小體、明顯的點狀壞死和灶性壞死，壞死灶可見大量炎性細胞浸潤;匯管區淋巴細胞和單核細胞炎性浸潤尤為明顯,肝竇內可見紅細胞淤積。葉下珠復方Ⅱ號高、中劑量組和聯苯雙酯組部分肝組織可見散在點狀壞死和灶性壞死，肝細胞損傷程度明顯減輕，炎性細胞浸潤顯著減少(圖1)。
2.2 葉下珠復方Ⅱ號對D?GalN致小鼠急性肝損傷模型的保護作用 由表2可知，模型組小鼠血清ALT、AST活性較正常對照組升高，肝組織SOD活性較正常組降低，差異均有顯著性意義(P<0.01)。除中藥低劑量組血清ALT外，中藥各組血清ALT、AST活性降低，肝組織SOD活性升高，與模型組比較有顯著性差異(均P <0.01)，與聯苯雙酯組比較差異無顯著性意義(P>0.05)。
肝臟組織病理學觀察：光鏡下見正常對照組肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結構完整，無病理性改變。模型組全部小鼠肝組織均出現病變，大多數肝細胞腫脹，細胞質疏松化，有的呈氣球樣變，可見廣泛的肝細胞脂肪變性、點狀壞死和灶性壞死，并出現炎性細胞浸潤。葉下珠復方Ⅱ號高、中劑量組和聯苯雙酯組肝細胞變性、壞死程度顯著減輕，炎性細胞浸潤減少,肝組織病變明顯改善(圖2)。表1 葉下珠復方Ⅱ號對Con A致肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝組織SOD活性的影響表2 葉下珠復方Ⅱ號對D?GalN所致肝損傷小鼠血清ALT、AST及肝組織SOD活性的影響
3 討論
Con A是一種被廣泛應用的可活化T細胞的有絲分裂原，ConA誘導的小鼠免疫性肝損傷模型，被認為更適合研究人類病毒性肝炎和自身免疫性肝病的病理機制和進行抗肝損傷的藥物篩選[4 -5]。ConA活化TH細胞后刺激TH細胞和巨噬細胞共同產生過量的干擾素γ(IFN?γ)和腫瘤壞死因子(TNF?α)等細胞因子，已證實TNF?α為細胞因子網絡中介導肝損傷的終末介質，它既是肝細胞凋亡的正性觸發因子,可直接損傷血管內皮細胞，亦可活化中性粒細胞促進其趨化聚集于肝臟，釋放蛋白酶或氧自由基引起肝細胞凋亡或壞死[6-7]。
D?GalN所致中毒性肝損傷模型的肝組織病理學和生化改變與人類病毒性肝炎相似，是評價保肝藥物效果和研究其作用機理的經典動物模型之一。以往認為D?氨基半乳糖氨引起的肝細胞損傷的機制是D?GalN在肝細胞內與尿苷二磷酸(UDP)結合，形成UDP?半乳糖氨復合物，使尿苷三磷酸(UTP)耗竭、尿苷類化合物環化不能進行，致使RNA和蛋白質合成受阻，最終導致肝細胞壞死[8]。近年的研究表明，D?GalN可引起肝細胞內鈣離子增多，鎂離子減少，鈣離子增多則抑制線粒體的呼吸功能，激活磷脂酶，分解膜磷脂，破壞溶酶體膜，使蛋白水解酶釋放，并使黃嘌呤脫氫酶轉化為黃嘌呤氧化酶，加速氧自由基的產生，引發脂質過氧化反應，破壞肝細胞膜結構，造成胞漿內可溶性酶如轉氨酶等滲入血液而活性升高，使肝細胞損傷進一步加劇[9-10] 。
SOD是氧自由基的清除劑，可抑制自由基啟動的脂質過氧化反應，肝細胞受到自由基攻擊時，SOD可因其過度消耗而減少，SOD活力的高低間接反映了機體清除自由基和抗組織過氧化損傷的能力[11] 。
本實驗采用Con A致免疫性肝損傷和D?GalN致化學性肝損傷兩種動物模型，觀察葉下珠復方Ⅱ號的抗肝損傷作用效果，結果表明葉下珠復方Ⅱ號可顯著性降低兩種實驗性肝損傷小鼠血清ALT和AST活性，升高肝損傷小鼠肝組織SOD活性，與模型組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，與聯苯雙酯組比較差異無顯著性意義(P>0.05)，且可明顯減輕肝組織病理變化。提示葉下珠復方Ⅱ號具有較好的降酶保肝作用，其作用可能與增強機體抗氧化能力，加速自由基的清除，抑制脂質過氧化損傷有關，確切機制有待進一步深入研究。
【參考文獻】
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