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SDS研究實(shí)驗(yàn)報(bào)告
一、研究背景及目的
對(duì)于那些生物體內(nèi)含量高、易于分離結(jié)晶獲得純品的蛋白，可以通過測定氨基酸序列，借助各種氨基酸的分子量求出蛋白的分子量，并與質(zhì)譜等手段相互結(jié)合，得到精確可信的分子量。但對(duì)于那些含量少，不易分離的蛋白，無法實(shí)現(xiàn)結(jié)晶，就必須借助其他手段測定其分子量。
要找到能夠測定分子量的實(shí)驗(yàn)手段，首先要考慮那些能夠?qū)⒉煌肿影凑掌涓髯缘姆肿恿糠蛛x的技術(shù)。在眾多的技術(shù)當(dāng)中，密度梯度離心、層析、電泳都與物質(zhì)的分子量有關(guān)。其中，超速離心機(jī)造價(jià)高，使用過濾層析色譜測分子量要做標(biāo)準(zhǔn)曲線，柱長要求高，且這些方法不夠準(zhǔn)確。因此，電泳技術(shù)成為了實(shí)現(xiàn)分子量測定這一目的的最佳選擇。
但是，在活性電泳中，影響蛋白前遷移率的因素有蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)、分子大小和形狀。要測定分子量，就要消除電荷、分子形狀對(duì)蛋白遷移率的影響，即使得各種蛋白的電荷、形狀不存在顯著差異。對(duì)于電荷，使各分子不帶電違背電泳的基本原理，而使各分子帶點(diǎn)完全相同是無法實(shí)現(xiàn)的，因此考慮使其帶上大量電荷，從而讓分子之間的電荷差異可以忽略。在活性電泳中，改變樣品的帶電情況依靠的是緩沖液pH的變化，顯然不能夠使分子大量帶電，這就表明必須向電泳體系中引入其他物質(zhì)，與蛋白分子定量等量結(jié)合，且不改變分子量差異造成泳動(dòng)差異。對(duì)于分子形狀，考慮到功能性蛋白大多是球形粒子，要保持形狀不變，就要實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的包裹性結(jié)合。而蛋白表面的電荷分布情況千差萬別，依靠電荷性質(zhì)無法結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物。考慮到蛋白質(zhì)中含有大量的疏水氨基酸，可以通過疏水作用結(jié)合，這就要造成蛋白變性，是疏水基團(tuán)充分暴露出來，分子不能在維持球型而變成棒狀，因此，所選擇的物質(zhì)還需要能夠維持復(fù)合物形狀的統(tǒng)一�；谝陨峡紤]，科學(xué)家選擇了雙親性物質(zhì)，既能通過疏水作用與蛋白定量結(jié)合成牢固的復(fù)合物，又能借助親水性在溶液中良好分散。
新技術(shù)的發(fā)明常以原有技術(shù)作為基礎(chǔ)。在活性電泳中，采用堿性體系，依靠濃縮效應(yīng)實(shí)現(xiàn)了樣品的濃縮，大大提高了分析的精度。而變性電泳屬于全蛋白染色，結(jié)果較準(zhǔn)確。在變性電泳中，要借助濃縮效應(yīng)，就要使樣品由負(fù)極向正極遷移，那么所選擇的物質(zhì)與蛋白結(jié)合之后要形成帶負(fù)電的復(fù)合物。就這樣，選擇了十二烷基硫酸鈉（SDS）作為變性劑。而且，發(fā)現(xiàn)形成的復(fù)合物成棒狀，短軸恒定，而長軸與分子量相關(guān)。所以，SDS就成為了理想的變性劑。這種方法最適宜測定分子量是15,000—100,000的樣品, 對(duì)低于10,000分子量的水解蛋白不太適用。通過改進(jìn)，用強(qiáng)電解質(zhì)離子為前導(dǎo)離子和拖尾離子可對(duì)分子量低于10，000的水解蛋白樣品進(jìn)行分子量測定。用這種方法測定蛋白質(zhì)的分子量,分辨率高，所需設(shè)備廉價(jià)，與用其他方法測得的分子量相比，誤差一般在±10%以內(nèi)，因而其廣泛應(yīng)用于蛋白分離純化和分子量測定。
因此，SDS-PAGE是目前常用的測定蛋白質(zhì)分子量的方法。本實(shí)驗(yàn)通過利用SDS-PAGE測定實(shí)驗(yàn)四純化的麥清蛋白，學(xué)習(xí)和掌握SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量的原理，掌握其具體操作；并與活性電泳進(jìn)行對(duì)比，了解其異同，加深對(duì)電泳技術(shù)了理解。
二、實(shí)驗(yàn)原理
1、聚丙烯酰胺凝膠電泳可對(duì)蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量做定性分析，帶電蛋白質(zhì)分子在電場作用下將作定向移動(dòng),在其他條件( 電場、介質(zhì)粘度等) 不變的情況下, 蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移速率受分子所帶凈電荷量與分子大小、形狀等因素的影響。如果兩種不同分子量的蛋白質(zhì)的分子大小的差異被所帶凈電荷量的差異所補(bǔ)償時(shí),則這兩種不同分子量的蛋白質(zhì)可以相同的速率電泳,無法通過電泳距離測定蛋白質(zhì)的分子量。因而要測定分子量則需要蛋白質(zhì)以分子量為唯一變量進(jìn)行泳動(dòng)，即需要引入某種物質(zhì)與蛋白結(jié)合消除凈電荷和分子形狀的影響。
由于變性電泳由活性電泳發(fā)展而來，濃縮效應(yīng)是在堿性體系下建立的，在此體系下蛋白質(zhì)帶負(fù)電，又由于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)普遍低于7，在堿性體系下不同蛋白質(zhì)所帶電荷量不同，自身差異更大，分離效果更好。因而要引入的這一能消除蛋白質(zhì)自身所帶凈電荷的物質(zhì)在電泳體系下應(yīng)帶負(fù)電荷。另一方面，我們要引入的物質(zhì)應(yīng)能與蛋白質(zhì)普遍穩(wěn)定地定量結(jié)合，結(jié)合后不同分子量的多肽鏈形狀類似，使各多肽鏈間的差別集中在分子量上。
通過試驗(yàn)與實(shí)踐，人們找到了一種雙親性物質(zhì)即SDS，SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱，是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，SDS以其疏水基和蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)相結(jié)合，形成牢固的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物，由于SDS的結(jié)合，所引入的凈電荷大約為蛋白質(zhì)本身凈電荷的10倍，使SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物所帶電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)原有的凈電荷，從而消除或大大降低不同蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的不同對(duì)電泳遷移率的影響。在分子形狀方面，SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物具有扁平而緊密的橢圓形或棒狀結(jié)構(gòu)，棒的短軸是恒定的，在18A數(shù)量級(jí)，與蛋白質(zhì)種類無關(guān)，棒的長軸是變化的，其變化正比于蛋白質(zhì)分子量。說明SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合所形成的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物消除了由天然蛋白質(zhì)形狀的不同而對(duì)電泳遷移率的影響。
2、在SDS的存在下，蛋白質(zhì)在電場中泳動(dòng)時(shí)其遷移率僅與蛋白質(zhì)分子質(zhì)量有關(guān)。二者的關(guān)系式為：lgM=ab
其中，M為相對(duì)分子質(zhì)量，Rm為相對(duì)遷移率——蛋白質(zhì)在凝膠中的遷移距離與指示劑前沿距離的比值，a、b為常數(shù)。從上式可知，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)與蛋白質(zhì)遷移率呈線性負(fù)相關(guān)。在同一塊電泳凝膠上對(duì)一組已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)和蛋白樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率為橫坐標(biāo)，以分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從未知蛋白質(zhì)的遷移率即可求出蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量。
三、儀器與試劑
實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)四麥清蛋白脫鹽樣品
實(shí)驗(yàn)試劑：三羥甲基氨基甲烷（Tris）；丙烯酰胺（Acr）；甲叉雙丙烯酰胺（Bis）；十二烷基硫酸（SDS）；N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）；過硫酸銨；甘油；巰基乙醇；異丙醇；溴酚藍(lán)；考馬斯亮藍(lán)R-250；甘氨酸；鹽酸；乙酸；冰乙酸。
實(shí)驗(yàn)儀器：直流穩(wěn)壓電源（600V，100mA）；移液器；燒杯（50ml×2）；實(shí)驗(yàn)儀器：DYY-Ⅲ2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠）；DYY-III2電泳槽（北京市六一儀器廠）；微量進(jìn)樣器50μl（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）；大培養(yǎng)皿一套。
試劑配制：
實(shí)驗(yàn)儀器：DYY-III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀一套（北京市六一儀器廠）、燒杯50ml×3，微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠）、大培養(yǎng)皿一套、微量可調(diào)手動(dòng)移液器（大龍）。
四、實(shí)驗(yàn)方法
1、貯液配制（教師完成）
按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)43頁配制貯液，注意：配好的丙膠貯液盛于棕色瓶中置冰箱中保存，可放1~2個(gè)月；過硫酸銨和染色液應(yīng)當(dāng)天配制；電極緩沖液用時(shí)稀釋10倍；如有不容物應(yīng)當(dāng)過濾。
2、凝膠的制備
（1）將貯液由冰箱取出，待與室溫平衡后再配制工作液。
�。�2）安裝電泳槽。安裝時(shí)，注意旋緊螺絲時(shí)要均衡用力，以免夾碎玻璃片。
�。�3）用2%瓊脂封底，以防漏膠。
�。�4）按下表所示配制分離膠
在小燒杯中混勻后，立即灌膠。灌膠時(shí)，將電泳槽稍傾斜，用手扶穩(wěn)，將小燒杯尖端抵在長玻璃片頂端，小心將溶膠倒入兩玻璃片之間，灌至據(jù)短玻璃片頂端2cm左右即可，放平電泳槽，立即用滴管在膠的上層小心輕緩地覆蓋2~3mm的水層。灌注水層是要均勻輕緩，以防在膠頂部產(chǎn)生漏洞，影響結(jié)果，剛加水時(shí)，可以看出界面，后逐漸消失；等到再出現(xiàn)界面時(shí)，表明分離膠已經(jīng)聚合，再靜置一會(huì)兒，將水倒出，用濾紙條從一側(cè)略微吸浸，注意不要碰毀膠面，準(zhǔn)備灌注濃縮膠。
（5）按下表配制濃縮膠
混勻后立即灌膠，操作同上，至膠面與短玻璃片頂端平齊，立即插入樣品槽模板（梳子）。聚合完成后，在電泳槽內(nèi)倒入電極緩沖液，使短玻璃片一側(cè)電極緩沖液沒過玻璃片頂端，長玻璃片一側(cè)電極緩沖液沒過電極絲，然后小心拔出梳子，準(zhǔn)備點(diǎn)樣。
3、樣品的處理
Marker：市售標(biāo)準(zhǔn)樣品按要求制備。
待測樣品：麥清蛋白初步提取的凝膠過濾脫鹽實(shí)驗(yàn)所獲峰值管制備的SDS-PAGE樣品。 所有樣品于沸水浴中加熱5min，冷卻后上樣。
上樣量：Marker 20μl，待測樣品4μl、10μl、20μl、30μl、50μl。
4、電泳
接好電源線（上槽接負(fù)極，下槽接正極）。打開電源開關(guān)，調(diào)節(jié)電流，初始時(shí)控制在15mA左右，當(dāng)前沿進(jìn)入分離膠后，可調(diào)節(jié)電流到25mA左右。實(shí)驗(yàn)中溴酚藍(lán)前沿指示劑不能跑丟。
5、檢測
電泳結(jié)束后，取出膠板，現(xiàn)在水中浸泡10min，以浸出部分SDS，然后把膠板轉(zhuǎn)到染色液中過夜，將蛋白質(zhì)固定并染色（或加熱2h，在通風(fēng)櫥中操作）。然后用脫色液脫至條帶清楚，觀察記錄結(jié)果。
6、測定蛋白質(zhì)樣品的遷移率和未知樣品的分子量
用卡尺或坐標(biāo)精確測量溴酚藍(lán)和各種蛋白質(zhì)遷移的距離，記溴酚藍(lán)遷移的距離為d1，蛋白質(zhì)遷移的距離為d2，根據(jù)下面的公式計(jì)算出各種蛋白質(zhì)的遷移率Rm：Rm=d2/d1。
以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率為橫坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的分子量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作圖。然后給句待測樣品的遷移率，在圖上查出其對(duì)應(yīng)的分子量。并由所得結(jié)果分析實(shí)驗(yàn)四麥清蛋白初步提取的實(shí)驗(yàn)效果以及后續(xù)進(jìn)一步分離純化的方案。
五、數(shù)據(jù)整理及結(jié)果計(jì)算與討論及分析
�。ㄒ唬┙Y(jié)果計(jì)算與分析
以marker蛋白的遷移率Rm為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)蛋白分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，做出本次實(shí)驗(yàn)的SDS-PAGE分子質(zhì)量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
有上可得，標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y = -1.1355x + 5.0731。其R2 = 0.9639，曲線可用。將麥清蛋白的相對(duì)遷移率0.2287帶入曲線方程，得到其分子量的對(duì)數(shù)為4.8134，則其分子量為65072Da，約為65.1kDa。
�。ǘ┯懻�
本次實(shí)驗(yàn)與上次的活性電泳不同，除了跑在最前面的溴酚藍(lán)前沿，還有一個(gè)蛋白前沿。蛋白前沿的產(chǎn)生是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中有些蛋白降解為較短的小肽段，分子量僅比溴酚藍(lán)大一些，遷移速度超出了其他蛋白，且在膠板中發(fā)生側(cè)向擴(kuò)散，形成蛋白前沿。同時(shí)，靠近蛋白前沿的部分有大量分子量較小的蛋白樣品聚集，它們并非我們需要 品，因?yàn)榉蛛x膠不夠長而沒有分開。
本次實(shí)驗(yàn)我組順利的將marker的七條帶均勻跑開并顯現(xiàn)出來，說明這次實(shí)驗(yàn)中我組在操作上基本無大的問題。對(duì)于最后一條marker帶出現(xiàn)上翹情況，經(jīng)與老師分析討論后，認(rèn)為對(duì)于偏向下部的條帶尤其是靠近底部的條帶，會(huì)受到膠板邊緣效應(yīng)的影響，會(huì)發(fā)生偏折。因此在今后的實(shí)驗(yàn)操作中，對(duì)于這種情況，應(yīng)避免使用此處的marker進(jìn)行計(jì)算。
我們指定了靠近Marker第二條帶的一條顏色很深的條帶作為目標(biāo)蛋白，這是因?yàn)檫@一蛋白含量相對(duì)較高，與其他蛋白明顯分離開來。通過上面的計(jì)算，得到這種蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為65.1kDa。
在對(duì)Marker進(jìn)行作圖的時(shí)候，我們發(fā)現(xiàn)116.0kDa的條帶并不在直線上，其遷移的距離明顯超過了應(yīng)有的遷移距離，說明在電泳過程中這個(gè)蛋白遷移速度過快�？紤]到其他條帶的遷移正常，我們認(rèn)為可能的原因有兩個(gè)：一是Marker本身的質(zhì)量問題，標(biāo)稱116.0kDa的蛋白分子量不足116.0kDa；二是凝膠組成的問題。實(shí)驗(yàn)中所用的凝膠孔徑過大，導(dǎo)致凝膠對(duì)分子量最大的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的阻礙作用不足，使這個(gè)蛋白遷移速度超出了本來應(yīng)有的速度。
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