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益母草中益母草堿的HPLC檢測論文
目的 建立益母草中益母草堿的HPLC檢測方法。方法 C18色譜柱，流動相：甲醇?pH=1.7的醋酸/醋酸鈉緩沖液（體積比85∶15），流速0.6 mL·min-1，檢測波長277 nm，靈敏度0.1AUFS，柱溫25 ℃。結果 益母草藥材中益母草堿的質量分數為0.015％;平均回收率為100.08%，RSD為0.15%。結論 高效液相色譜直接檢測益母草堿，簡便易行，結果準確可靠。益母草為唇形科植物益母草(Leonurus heterophyllus Sweet)的干燥地上部分，以花蕾期的地上部分的干品或鮮品入藥，性味苦、辛、微寒，歸肝、心包經，具有活血調經、化瘀生新、收縮子宮之功效，主治月經不調、胎漏難產、行經腹痛及產后淤阻等證，素有“血家圣藥”、“經產良藥”之稱。益母草中主要含有生物堿類、二萜類、甾醇、黃酮類、有機酸、脂肪酸類等成分。益母草中生物堿以益母草堿和水蘇堿為主［1］。
藥理作用研究證明，益母草中的主要有效成分益母草堿(leonurine)具有顯著的直接擴張外周血管、增加血流量、抗血小板聚集活性等作用［2］，
可有效的降低血液黏度和提高紅細胞的變形能力，還可調經止血，保護心肌缺血再灌注損傷。在《中國藥典》
［3］及各級別標準中，益母草藥材和益母草制劑的質量控制均是以總生物堿為指標，文獻［4，5］則采用雷氏鹽剩余比色法測定益母草中鹽酸水蘇堿。而對于益母草堿的含量卻沒有要求，這樣不能保證益母草及其制劑的安全、有效。以益母草為原料的多種制劑，如益母草膠囊、益母草沖劑、益母草口服液、益母草浸膏、益母草片等都是臨床上的常用品，除個別品種在《中國藥典》2005年版增加了含量測定項目外，多數品種無統一標準，有的品種則無含量測定要求，使市售的產品質量得不到保證。所以建立一個以益母草堿為指標直接檢測益母草藥材及其制劑的統一的質量標準是很有意義的。本文嘗試建立益母草堿的高效液相色譜直接檢測方法。
1 儀器與材料
高效液相色譜儀LabAlliance， LabAlliance紫外檢測器Model 5000， Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm),Anastar色譜工作站；紫外分光光度計，SHIMADZU公司，UV2401PC。甲醇為一級色譜純；益母草堿對照品（購于安徽省新星藥物開發有限責任公司，純度為99％）；益母草（購于天津市南開區協和藥店，經我校中藥學院中藥鑒定教研室張麗娟副教授鑒定）。
2 方法與結果
2.1 紫外光譜最大吸收測定 在200~400 nm之間進行全波長掃描，掃描圖如圖1所示，益母草堿在215 nm和277 nm處均有吸收峰，最大吸收277 nm，故選用277 nm作為高效液相測定的波長。
2.2 色譜條件色譜柱：Phenomenex C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相：甲醇?pH=1.7的醋酸/醋酸鈉緩沖溶液（體積比85∶15），流速：0.6 mL·min-1，檢測波長：277 nm，靈敏度：0.1AUFS，柱溫：25 ℃，進樣量：20 μL。
2.3 對照品溶液的制備精密稱取鹽酸益母草堿0.6 mg，溶于25 mL流動相中，搖勻，制得0.024 mg·mL-1對照品溶液。分別取對照品溶液0.5、 1.0、1.5、2.0、5 mL溶于5 mL流動相中，分別搖勻，得質量濃度分別為0?0024、0.0048、0.0072、0.0096、0.024 mg·mL-1的對照品溶液。各用微孔濾膜濾過后，按“2.2.1”項下的色譜條件進樣測定（HPLC分析如圖2所示），測得各溶液峰面積，計算得回歸方程：C=2.222×10-8A－6.213×10-4,r=0.9998。益母草堿在0?0024~0.024 mg·mL－1間呈現良好的線性關系。
圖1 全波長掃描圖（略）
Fig.1 Wavelength scanning of motherwort alkaloids
圖2 對照品HPLC分析圖（略）
Fig.2 HPLC chromatogram of reference substance
2.4 樣品溶液的制備精密稱取益母草提取物粗品2.2 mg，溶于10 mL流動相中，搖勻即得。
2.5 樣品溶液的測定取樣品溶液用微孔濾膜濾過后，按“2.2.1”項下的色譜條件進樣測定，測得溶液的峰面積為1 099 398，計算質量分數為10.82％，在原藥材中的質量分數為0.015％。
2.6 精密度試驗取同一樣品溶液，按“2.2.1”項色譜條件下重復進樣6次，測得峰面積分別為1 106 469、1 110 843、1 099 260、1 106 190、1 103 044、1 112 296，平均峰面積為1 106 350.3，計算得RSD=0.98%。表明儀器精密度符合要求。
2.7 穩定性試驗取同一樣品溶液于室溫下在配制后的0、2、4、6、8、10、12 h，按“2.2.1”項下的色譜條件進樣測定，測得峰面積分別為1 108 469、1 099 351、1 120 020、1 123 215、1 110 362、1 109 472、1 137 277，平均峰面積為1 115 452.3，結果RSD＝1.11％，可見供試品溶液在室溫條件下12 h內穩定。
2.8 重現性試驗取同一樣品溶液6份，按“2.2.1”項下色譜條件分別測定測得質量分數分別為10.82％、10?83％、10.79％、10.80％、10.81％、10.83％，平均為10.81％，RSD＝0.15％。
2.9 加樣回收率試驗取益母草堿粗制品3.6 mg,用流動相溶解后，精密加入益母草堿對照品0.4 mg，溶液適量，置于25 mL容量瓶中，以流動相定容至刻度，搖勻。再按樣品測定方法操作測定，測得6次的峰面積分別為790 165、786 492、807 343、810 706、799 324、813 338，平均峰面積為801 228，結果計算回收率為100.08％，RSD＝1.54％。
3 討論
3.1 波長的確定 在200～400 nm之間進行全波長掃描，發現有兩個吸收峰，215 nm和277 nm，但是215 nm有可能受到甲醇吸收的影響，而且在277 nm處沒有其他成分的干擾，所以選擇最大吸收波長277 nm作為檢測波長。
3.2 色譜條件的建立 分別考察了不同體積比的甲醇?水、甲醇?水?三乙胺、甲醇?水?冰醋酸、甲醇?緩沖溶液等流動相，最終選擇甲醇?緩沖溶液作為流動相。選擇用酸性流動相，是因為益母草中益母草堿的存在形式有可能有兩種，即益母草堿單體及其鹽類，利用酸性流動相可以轉化成鹽類一種形式，測定時只出現單一的峰。選擇緩沖溶液，是因為緩沖溶液是一個平衡體系，比較穩定，有利于實驗的進行。
3.3 本文是在完成了分離益母草堿和水蘇堿的基礎上實現了益母草堿的高效液相色譜的直接檢測方法，為益母草藥材的質量控制及其他益母草制劑的質量控制提供了依據。該方法簡便易行，結果準確可靠。
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