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聚酰胺分離純化薇菜黃酮
聚酰胺分離純化薇菜黃酮
摘要：以薇菜為原料提取黃酮類化合物，以上樣量、洗脫流速、乙醇濃度為考察對象，采用聚酰胺柱層析法優化分離純化工藝條件。
結果表明：最佳分離工藝參數為上樣量3mL(濃度0.749mg/mL)、70%的乙醇、200mL/h的流速洗脫，譜峰較窄，洗脫峰的黃酮含量達到14.45%。
此法可較好地分離純化薇菜黃酮類化合物，經濟實用。
關鍵詞：薇菜;黃酮;聚酰胺樹脂;分離純化
薇菜屬蕨類植物門(Pterdophta)、紫萁屬(Osmunda)多年生蕨類植物。
以初生嫩葉干制后食用，具有很高的營養價值和經濟價值，含有豐富的蛋白質、多糖、黃酮、脂肪、纖維素、礦質元素等營養物質，深受消費者青睞。
薇菜富含黃酮類化合物，據研究，黃酮類化合物有抗癌、抗衰老、治療骨病和骨質疏松等功效，具有提高記憶力、抗過敏、活血化瘀、利膽及肝臟保護作用H。
麥葉中提取的黃酮類化合物對超氧陰離子自由基(02・)、羥基自由基(・OH)有清除作用，能抗氧化。
目前，關于薇菜黃酮類化合物的分離純化工藝學研究方面的報道少見，尚不成熟。
本研究采取超聲波萃取法，對薇菜中黃酮類化合物進行提取工藝及用聚酰胺樹脂分離純化工藝的研究，尋求最佳的提取分離純化條件，以推進植物資源的有效開發利用。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試驗材料。
薇菜采回后洗凈，置于105%烤箱中烘烤0.5h，然后置于90%烤箱中烘干，粉碎后過80目篩，備用。
1.1.2儀器設備。
日本島津公司生產的UV一2550型分光光度計;日本Hitachi公司生產的CR一21G型離心機;上海錦屏儀器儀表有限公司生產的數顯水浴鍋;寧波新芝生物科技股份有限公司生產的超聲波;廣州儀科實驗技術有限公司生產的磁力攪拌器;上海瀘西分析儀器廠有限公司生產的2.6cm×20cm層析柱;上海瀘西分析儀器廠有限公司生產的HL-2恒流泵;上海瀘西分析儀器廠有限公司生產的Bs-100A自動收集器。
2.2方法
2.2.1黃酮含量的測定。
按照九里香總黃酮提取工藝的方法進行，得回歸方程為：y=0.7083x-0.0065(R2=0.9997)。
將提取的黃酮粗液按照標準曲線的操作方法測定其吸光度，利用回歸方程即可計算黃酮的含量。
2.2.2樣品脫色處理。
稱取適量薇菜粉末，置于500mL燒杯中，加石油醚進行脫色處理。
在常溫下，使用磁力攪拌器不斷攪拌，重復3次，每次5h，抽濾、搗碎，放在90%烤箱中烘干備用。
2.2.3薇菜粗黃酮提取分離。
薇菜粗黃酮提取分離參照薇菜葉總黃酮提取工藝條件優化的方法進行。
2.2.4薇菜粗黃酮的分離純化。
(1)聚酰胺樹脂的預處理。
稱取600g聚酰胺粉末于1L的燒杯中，倒入95%的新鮮乙醇煮沸0.5h，然后離心甩干，倒入新鮮乙醇煮沸，重復3次即可上柱。
(2)聚酰胺的純化方法。
稱取45g備用聚酰胺樹脂，濕法裝入內徑為2.6cm×20cm的層析柱中，靜置30min，用5BV超純水洗脫水溶性小分子物質。
室溫下，取不同上樣量的提取液以不同的流速通過樹脂，再用不同濃度的乙醇溶液洗脫，測定其洗脫液的黃酮含量，從而考察上樣量、洗脫流速、洗脫乙醇濃度等因素對薇菜黃酮洗脫率的影響。
(3)洗脫液黃酮檢驗。
將收集的洗脫液，每管取2mL于試管中，測定黃酮含量，并計算洗脫峰的洗脫率。
3結果與分析
3.1上樣量對薇菜黃酮洗脫率的影響
分別取1mL、2mL、3mL、4mL黃酮提取液上樣，控制洗脫液流速200mL/h，5BV超純水洗脫，然后用70%乙醇溶液洗脫收集。
圖1～4可知，隨著上樣量的增加，最大的洗脫率分別為5.45%、9.73%、14.45%、17.13%，均出現在5～8管之間。
3.2洗脫流速對薇菜黃酮洗脫率的影響
取3mL(濃度為0.749mg/mL)黃酮提取液上樣，分別控制100、200、300、400 mL/h洗脫液流速，5BV超純水洗脫，然后用70%乙醇溶液洗脫收集。
圖5～8可知，隨著洗脫流速依次減小，洗脫峰時黃酮含量分別為9.03%、8.50%、14.45%、8.93%。
洗脫液的流速影響層析的分離效果，速度慢會造成分離時間長，譜峰變寬、流速快。
洗脫速度通常要保持恒定，根據實際情況，流速為200mL/h適宜薇菜黃酮類化合物的分離。
3.3乙醇濃度對薇菜黃酮洗脫率的影響
取3mL(濃度為0.749mg/mL)黃酮提取液上樣，分別用30%、50%、70%、90%的乙醇洗脫，洗脫流速控制200mUh洗脫液流速，5BV超純水洗脫，然后用70%乙醇溶液洗脫收集。
試驗表明，從圖9～11看出，用50%、70%、90%的乙醇洗脫，黃酮類化合物的洗脫率分別為5.67%、14.45%、7.37%，隨著乙醇濃度的增大，黃酮的洗脫率先增加后減小。
4討論
聚酰胺柱層析法純化薇菜黃酮提取液的最佳工藝參數為上樣量為3mL(濃度為0.749mg/mL)、控制流速200mL/h、乙醇洗脫濃度為70%、洗脫率為14.45%。
選擇上樣量是提高洗脫率和直接影響黃酮純化的重要因素，當上樣量較大時，在柱子中形成1條較寬的洗脫帶。
在流速和洗脫濃度一定的條件下，洗脫帶過寬不利于高純度黃酮的形成。
當上樣量剛好在柱子中形成薄薄的一層，便于洗脫，上樣量過大，聚酰胺吸附帶寬，洗脫時拖尾現象嚴重。
因此，選擇上樣量為3mL(濃度為0.749mg/mL)較適合薇菜黃酮分離純化，控制洗脫流速可以提高分離純化薇菜黃酮。
乙醇濃度是洗脫薇菜黃酮類化合物的關鍵，由于薇菜中黃酮類化合物的溶解度不同，在分離洗脫過程中，70%乙醇洗脫效果最佳。
每個處理收集的洗脫液，第5～10管黃酮含量相對于其它管高很多，證明薇菜中主要含有的黃酮類化合物成分集中在這一區域。
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