林可霉素生物合成技術

　　林可霉素生物合成技術

　　【摘要】在合成培養基中利用林可鏈霉菌發酵生產林可霉素。

　　當向培養基中加入生物素和氨基酸時，林可霉素的產量受到很大影響。

　　【關鍵詞】林可霉素 生物合成

　　林可霉素是一種高效廣譜抗生素，臨床用于由抗革蘭陽性菌引起疾病的治療。

　　林可霉素A的分子式為C18H34N2O6S，分子量為406.56，它與林可霉素B在結構上的區別為：林可霉素A 4位上為正丙基，而林可霉素B4位上是乙基， 兩者在藥理上存在著很大的區別，林可霉素B的抑菌活性比林可霉素A低，但對人的毒副作用較大。

　　我國藥典要求成品中B含量小于5%。

　　本文采用合成培養基進行搖瓶發酵實驗，選擇玉米漿中含量較豐富的D�生物素、L�谷氨酸、L�纈氨酸等15個因子首先進行兩水平因子設計實驗，以篩選出顯著影響因子，然后進行響應面設計實驗，通過軟件分析得到優化的發酵培養基配方。

　　一、 材料與方法

　　1、 菌種

　　林可鏈霉菌(Streptomyces lincolnensis)L�427，由江西國藥有限公司提供。

　　2 、 培養條件與培養方法

　　種子培養種子搖瓶于30℃，220r/min培養48h。

　　搖瓶發酵培養 按30%的接種量將種子液接入發酵培養基，30℃，220r/min，培養168h。

　　3、 生物效價的測定

　　采用管碟法。

　　鑒定菌為藤黃八疊球菌[Sarcina lutea，CMCC(B)28001]，由江西國藥有限責任公司提供。

　　林可霉素(lincomycin)標準品購自Sigma公司。

　　二、結果與討論

　　1 、 實驗設計

　　通過兩水平因子設計(2 Level Factorial Design)實驗可迅速找出生物素和氨基酸中對林可霉素的發酵生產有顯著影響的因子，進一步對顯著影響因子進行響應面設計(response surface design，RSD)實驗，對結果進行優化分析可得到優化配方。

　　所采用的實驗設計、數據分析軟件為Design Expert 7.0。

　　(1)兩水平因子設計 該設計可從大量影響因子中快速找出顯著影響因子，設計方案和結果如表1所示。

　　用軟件進行分析，得知設計模型的F值為18.05，由于噪聲影響而出現大于F值的概率僅為0.02%，故本設計模型是顯著的。

　　曲率的F值為19.62，出現比F值大的幾率僅為0.16%，說明模型的響應曲面圖顯著彎曲，提示模型具有很強的顯著性。

　　鑒于此，選擇生物素、谷氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和酪氨酸作為影響發酵生產林可霉素的關鍵因素，進行響應面設計。

　　其他可信度較小的因素對林可霉素的發酵生產無顯著影響，在下一步的培養基優化中不予考慮。

　　(2)響應面設計 將6個顯著影響因子進行響應面設計中的中心組合設計(central composite design，CCD)，可得出響應值(生物效價)關于各顯著影響因子的多項二次擬合方程，再對響應面進行分析，可得響應值與各因子之間、因子與因子之間的相互關系，經過綜合分析得出整個響應區域中響應值的最優值和影響因子含量的最佳組合。

　　①中心組合設計 6個顯著影響因子D�生物素(a)、L�谷氨酸(b)、L�纈氨酸(c)、L�蛋氨酸(d)、L�亮氨酸(e)和L�酪氨酸(f)的濃度范圍分別為30～100μg/L，90～190、30～130、20～120、40～1400和20～120mg/L。

　　設計方案和實驗結果如表2所示，“-1”、“0”和“1”分別表示對應影響因子的最低濃度值、中間濃度值和最高濃度值。

　　軟件分析得知，模型的擬合度(R�Squared)為0.997，說明預測值與實測值之間具有高度的相關性;校正決定系數(Adj R�Squared)為0.9809，說明該模型能解釋98.09%響應值(Titres)的變化,僅有總變異的1.91%不能用此模型來解釋;模型的信噪比(Adeq Precision)為23.723，一般來說，模型的信噪比大于4就是較好的模型，進一步說明本模型設計是非常成功的。

　　②分析與優化 利用軟件對生物效價預測值與顯著影響交互項ab、ac、ad、ae、af、bc、cd、ce、ef之間的響應面圖進行分析，得知上述交互作用項對生物效價的影響很大，在低濃度范圍內，生物素濃度越低，生物效價的預測值越大;谷氨酸和纈氨酸之間、纈氨酸和亮氨酸之間以及亮氨酸和酪氨酸之間對生物效價的影響具有顯著的正協同效應;纈氨酸和蛋氨酸對生物效價的影響存在拮抗效應，纈氨酸濃度較高和蛋氨酸濃度較低時，預測效價值較高。

　　對上述結果進行分析可知，低濃度的生物素對林可鏈霉菌的糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝有促進作用;林可鏈霉菌對谷氨酸的需求量較高，可能是因為其參與較多的脫氨基和轉氨基反應，生成了較多的α�酮戊二酸等中間產物，一方面對三羧酸循環有強化作用，另一方面可為林可霉素的生成提供豐富的中間產物;纈氨酸和亮氨酸為分支氨基酸，它們脫氨基可生成支鏈脂肪酸，對林可鏈霉菌的生長有刺激作用;酪氨酸為林可霉素A合成的前體，補入適量的前體，可提高林可霉素A的合成速率和產量。

　　蛋氨酸為去甲基林可胺轉甲基反應的甲基供體，它對林可霉素的合成速率可能具有較大的限制作用，而纈氨酸對林可霉素的生長具有刺激作用，菌體生長與林可霉素的合成在某種程度上說是一種相互制約的關系，這樣就表現為蛋氨酸和纈氨酸之間的拮抗作用，而且林可霉素的合成要求有較高的菌濃，故培養基中應適當增加纈氨酸的濃度，相應適當降低蛋氨酸的濃度。

　　3 、 驗證實驗

　　為了檢驗優化結果的有效性，在搖瓶中同步進行了優化組、對照組I(培養基中無生物素和氨基酸)和對照組II(培養基中按原配方加入6個顯著影響因子)的驗證實驗，結果如表4所示。

　　三、結論

　　在化學合成培養基中用林可鏈霉菌發酵生產林可霉素，通過兩水平因子設計實驗對生物素和氨基酸組分進行篩選，得出六個對生物效價有顯著影響的因子：D�生物素、L�谷氨酸、L�纈氨酸、L�蛋氨酸、L�亮氨酸和L�酪氨酸;通過響應面設計實驗和軟件的優化分析得到上述六個顯著影響因子的含量分別為30μg/L及100.5、83、29、117.5和58.5mg/L時，最終發酵液的最大預測效價為2275μg/ml。

　　采用優化配方進行搖瓶實驗，最終發酵液的生物效價為2116μg/ml;而采用對照I和II配方進行搖瓶實驗，最終發酵液的生物效價分別為893和1481μg/ml，即采用優化配方相對于采用對照I和II配方在生物效價方面提高的百分含量分別為136.62%和42.88%。

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