- 相關(guān)推薦
微生物培養(yǎng)技術(shù)初探-農(nóng)業(yè)生物技術(shù)論文
論文摘要：文章簡(jiǎn)要介紹了微生物不可培養(yǎng)的原因，總結(jié)了培養(yǎng)技術(shù)中存在的問(wèn)題，提出如何改良培養(yǎng)微生物的技術(shù)，并闡述了模擬自然環(huán)境條件、強(qiáng)調(diào)微生物相互關(guān)系是提高微生物可培養(yǎng)性的關(guān)鍵。
論文關(guān)鍵詞：微生物;培養(yǎng)技術(shù);環(huán)境條件;生物細(xì)胞
目前自然界中只有極少部分微生物能夠得到培養(yǎng)，嚴(yán)重阻礙了對(duì)微生物生命活動(dòng)規(guī)律的研究和微生物資源的開(kāi)發(fā)。因此必須改進(jìn)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，采用新型培養(yǎng)技術(shù)，提高微生物可培養(yǎng)性，大量培養(yǎng)自然界中存在的微生物，從而更全面、準(zhǔn)確地了解微生物細(xì)胞的生命規(guī)律、獲悉微生物群落中各種微生物之間的動(dòng)態(tài)相互作用和相互協(xié)調(diào)的規(guī)律，對(duì)環(huán)境微生物工藝進(jìn)行準(zhǔn)確地設(shè)計(jì)、精細(xì)地調(diào)控和高效地利用。
一、微生物不可培養(yǎng)的原因
對(duì)微生物進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)時(shí)，由于生活條件的改變，有些微生物不能適應(yīng)而死亡，另一些則通過(guò)產(chǎn)生孢子進(jìn)入休眠狀態(tài)或改變細(xì)胞形態(tài)、進(jìn)入維持一定代謝活性但不生長(zhǎng)繁殖的“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”，結(jié)果均表現(xiàn)為微生物的“不可培養(yǎng)性”。
實(shí)際上，微生物的不可培養(yǎng)性是由于對(duì)微生物生長(zhǎng)條件及其規(guī)律性的認(rèn)識(shí)嚴(yán)重不足，而采取了偏離微生物生長(zhǎng)實(shí)際情況的培養(yǎng)條件所造成的，這些偏離具體可以包括以下幾個(gè)方面：
(一)實(shí)驗(yàn)室中無(wú)法完全模擬自然界的環(huán)境條件
由于目前監(jiān)測(cè)技術(shù)和手段的限制，人們對(duì)微生物生存環(huán)境和自然條件的了解尚不充分。因此，人們沒(méi)有或無(wú)法完全模擬微生物的自然生存條件，而通常將培養(yǎng)條件進(jìn)行簡(jiǎn)化：將微生物置于恒溫、恒濕、黑暗等環(huán)境中;將微生物限制在“板結(jié)”的瓊脂或不擾動(dòng)的液體介質(zhì)中;簡(jiǎn)化微生物的營(yíng)養(yǎng)組成沒(méi)有提供微生物生長(zhǎng)繁殖所必需的某些化學(xué)物質(zhì)等等。所以在自然界中可以生長(zhǎng)繁殖的微生物，在“純培養(yǎng)”中生長(zhǎng)條件得不到滿足，從而導(dǎo)致了微生物的不可培養(yǎng)性。
(二)生長(zhǎng)緩慢的微生物被忽視
環(huán)境中很多微生物都聚集生長(zhǎng)，當(dāng)將這些微生物接種至培養(yǎng)基時(shí)，適合生長(zhǎng)的微生物由于生長(zhǎng)快而占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，它們對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的大量攝取使生長(zhǎng)緩慢的微生物得不到充足營(yíng)養(yǎng)而生長(zhǎng)受到抑制。
(三)采用高濃度的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)
最初對(duì)微生物的培養(yǎng)是在富含營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行的，但是由于自然界中微生物數(shù)量龐大，其可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏，多數(shù)處于“岔營(yíng)養(yǎng)”狀態(tài)。常規(guī)純培養(yǎng)對(duì)這種認(rèn)識(shí)不允分，通常將寡營(yíng)養(yǎng)微生物迅速置于富營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，微生物初期的快速生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生大量的、微生物自身難以調(diào)節(jié)的過(guò)氧化物、超氧化物和羥基自由基等“毒性氧物質(zhì)”，該類(lèi)物質(zhì)快速、過(guò)量的積累會(huì)破壞細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而表現(xiàn)出微生物的不可培養(yǎng)性。
(四)環(huán)境微生物之間的相互關(guān)系被忽略
微生物相互關(guān)系繁多復(fù)雜，包括：(1)種間的偏利共生關(guān)系和互惠共生關(guān)系，兩者的共性是至少一個(gè)群體提供另一些群體所需的生長(zhǎng)因子而使微生物群體獲利;(2)群體感應(yīng)，這種關(guān)系被認(rèn)為是通過(guò)細(xì)菌間的信息交流來(lái)調(diào)控細(xì)菌的群體行為：細(xì)胞通過(guò)感應(yīng)一種胞外低分子量的信號(hào)分子來(lái)判斷菌群密度和周?chē)h(huán)境的變化，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)的細(xì)菌表達(dá)以調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體行為。以上這兩種關(guān)系都是微生物生長(zhǎng)所必需的。由于人們目前對(duì)環(huán)境中微生物之間多數(shù)復(fù)雜的相互關(guān)系所知甚少，采用的培養(yǎng)技術(shù)沒(méi)有將這種關(guān)系考慮在內(nèi)。純培養(yǎng)技術(shù)將待培養(yǎng)的微生物與其它微生物群體、以及生存環(huán)境人為地分離開(kāi)，種間的共生關(guān)系和信息交流被阻斷，微生物缺乏必需的生長(zhǎng)因子和信號(hào)分了而死亡，表現(xiàn)出微生物的不可培養(yǎng)性。
(五)對(duì)微生物生長(zhǎng)狀況進(jìn)行判斷的常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)存在的缺陷，也導(dǎo)致某些微生物生長(zhǎng)不被發(fā)覺(jué)，表現(xiàn)為“不可培養(yǎng)”
例如，生存在貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中的微生物盡管能夠在低濃度營(yíng)養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，但是有些微生物生長(zhǎng)速度極為緩慢，在常規(guī)設(shè)定的培養(yǎng)周期內(nèi)(例如l周)沒(méi)有長(zhǎng)成肉眼可見(jiàn)的菌落就被遺棄。除此之外，還有一些寡營(yíng)養(yǎng)微生物不會(huì)形成菌落，而是在固體培養(yǎng)基表面遷徙生長(zhǎng)和擴(kuò)散生長(zhǎng)，它們形成只能顯微可見(jiàn)的幾個(gè)細(xì)胞組成的小型集合。這兩種情況下，改變微生物生長(zhǎng)的判斷標(biāo)準(zhǔn)或者檢測(cè)方法，就可以改變微生物的“不可培養(yǎng)性”。
總之，導(dǎo)致微生物不可培養(yǎng)的因素有多種，有些是因?yàn)槟壳凹夹g(shù)手段的限制，有些是因?yàn)槿祟?lèi)認(rèn)識(shí)水平的不足。克服這些制約因素，就可以較好地提高微生物的可培養(yǎng)性。目前，提高微生物可培養(yǎng)性的方式可分為兩大類(lèi)，即改進(jìn)培養(yǎng)措施和開(kāi)發(fā)新型培養(yǎng)技術(shù)。
二、目前微生物培養(yǎng)技術(shù)存在的問(wèn)題
目前通過(guò)可培養(yǎng)微生物的總體數(shù)量來(lái)判斷微生物可培養(yǎng)性，進(jìn)而評(píng)價(jià)微生物培養(yǎng)方法的優(yōu)劣，然而，這項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)沒(méi)有考慮可培養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)。實(shí)際上，表征微生物可培養(yǎng)性不僅僅要根據(jù)可培養(yǎng)微生物的總體數(shù)量，還要分析可培養(yǎng)微生物的群落結(jié)構(gòu)，即可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)豐富度和均勻度，微生物可培養(yǎng)性指標(biāo)應(yīng)該是這3種因子的函數(shù)，即：C=f(P，R，E)，其中：
C——微生物的可培養(yǎng)性，反映可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)和數(shù)量占實(shí)際微生物總種類(lèi)和數(shù)量的比例;
P——可培養(yǎng)微生物的細(xì)胞數(shù)(CFU/L)，即傳統(tǒng)可培養(yǎng)性的涵義;
R——可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)豐富度，即可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)數(shù)目;
E——可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)均勻度。
E=■=■
其中：H——香農(nóng)-韋納指數(shù);
Pi——種i的個(gè)體在可培養(yǎng)微生物全部個(gè)體中的數(shù)量比例。
該公式中，各因素的重要性為R>P>E，即可培養(yǎng)微生物的種類(lèi)豐富度重要性最高。
在目前實(shí)行的幾種培養(yǎng)方法中，模擬自然環(huán)境條件，維持微生物種群間的相互關(guān)系是提高環(huán)境中微生物可培養(yǎng)性的關(guān)鍵。因此，微生物培養(yǎng)技術(shù)的研究應(yīng)該主要圍繞在這一方面，進(jìn)行深入改進(jìn)和發(fā)展，例如，可考慮將環(huán)境微生物用環(huán)境介質(zhì)混合培養(yǎng)至生長(zhǎng)穩(wěn)定階段，然后將菌液離心過(guò)濾，用上清液作為培養(yǎng)基培養(yǎng)微生物，這些方法由于在培養(yǎng)過(guò)程中引入了多種微生物自然分泌的信號(hào)分子和促進(jìn)復(fù)活因子，均可較好地強(qiáng)化微生物之間的相互關(guān)系，而克服引入單一信號(hào)分子的效果有限且操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)。此外，在培養(yǎng)過(guò)程中結(jié)合多種培養(yǎng)因素、組合采取多種培養(yǎng)方案來(lái)取代模擬一種培養(yǎng)條件的方案，可以獲得更多可培養(yǎng)的微生物、取得更高效的培養(yǎng)結(jié)果。
三、培養(yǎng)微生物技術(shù)的改良措施
(一)減少毒性物質(zhì)的毒害作用
由于常規(guī)培養(yǎng)方法使用的高濃度營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)不利于微生物生長(zhǎng)，適當(dāng)降低營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的濃度可以減弱這種不利影響，研究發(fā)現(xiàn)低濃度基質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)出的細(xì)菌在數(shù)量和種類(lèi)上均多于高濃度基質(zhì)的培養(yǎng)基，但營(yíng)養(yǎng)濃度過(guò)低時(shí)反而會(huì)使培養(yǎng)出的微生物數(shù)量下降。實(shí)際上，營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)濃度最好與微生物自然生長(zhǎng)環(huán)境相近，例如，輔以少量生長(zhǎng)因子的天然海水或土壤浸提液作為培養(yǎng)基可以很好地培養(yǎng)海洋微生物和土壤微生物。另外，多聚物只有被水解為小分子物質(zhì)時(shí)才能被微生物利用。以多聚物為碳源，能有效減緩毒性氧釋放的速度，避免微生物在短時(shí)間內(nèi)受到高強(qiáng)度的毒性作用。同時(shí)，充足的氧氣有時(shí)也是毒性氧產(chǎn)生的原因之一，減少培養(yǎng)環(huán)境中的氧分壓可減弱毒性氧的影響。以上三種措施均可減少微生物代謝過(guò)程產(chǎn)生的毒性氧，但有些情況下，毒性氧來(lái)源于微生物生命活動(dòng)以外的過(guò)程，例如高壓滅菌。
為了減少各種過(guò)程產(chǎn)生的毒性氧，可向培養(yǎng)過(guò)程中加入具有毒性氧降解能力的物質(zhì)，例如過(guò)氧化氫酶、丙酮酸鈉等過(guò)氧化氫降解物和抗氧化劑二硫代二丙酸。已經(jīng)證實(shí)這些物質(zhì)可使某些處于VBNC狀態(tài)的細(xì)菌的可培養(yǎng)性得到不同程度的恢復(fù)。其中內(nèi)酮酸鈉對(duì)微生物可培養(yǎng)性恢復(fù)的效果最好，只有其有穩(wěn)定、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
(二)維持微生物間的相互作用
在培養(yǎng)基中加入微生物相互作用的信號(hào)分子就可簡(jiǎn)單模擬微生物間的相互作用，滿足微生物生長(zhǎng)繁殖的要求，例如加入�；兼滈L(zhǎng)度各異的氦酰高絲氨酸內(nèi)酯均能有效提高細(xì)菌的可培養(yǎng)性，而與革蘭氏陰性菌多種基因調(diào)控有關(guān)的另一種信號(hào)分子cAMP比氮酰高絲氨酸內(nèi)酯能夠促使更多細(xì)菌得到培養(yǎng)。同源性分析結(jié)果表明Rpf存在于多種革蘭氏陽(yáng)性菌中，推測(cè)原核生物可能廣泛存在該類(lèi)物質(zhì)，因此，可考慮加入同類(lèi)型的Rpf來(lái)提高環(huán)境中微生物可培養(yǎng)性。
(三)其他改進(jìn)措施
1.延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間：對(duì)“寡營(yíng)養(yǎng)菌”的培養(yǎng)，可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，使其能長(zhǎng)至肉眼可見(jiàn)的尺度。當(dāng)然培養(yǎng)時(shí)間不能無(wú)限增長(zhǎng)，因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌要求就越高。
2.供應(yīng)新型的電子供體和受體：不同微生物的代謝過(guò)程不同，因此對(duì)反應(yīng)的底物要求也不盡相同。供應(yīng)微生物需要的特有底物有助于新陳代謝反應(yīng)的進(jìn)行及微生物的正常生長(zhǎng)。大量的研究表明，將新穎的電子供體和受體應(yīng)用到微生物培養(yǎng)中，能夠發(fā)現(xiàn)未知的生理型微生物。
3.利用瓊脂替代物：瓊脂對(duì)某些微生物具有毒性作用，采用無(wú)害且凝結(jié)作用較好的替代物質(zhì)作為培養(yǎng)基固化劑，可以增加微生物的可培養(yǎng)性。
4.分散微生物細(xì)胞：自然界中很多微生物聚集生長(zhǎng)，形成“絮體”和“顆粒”等，致使其內(nèi)部的微生物不易被培養(yǎng)。對(duì)“絮體”和“顆粒”進(jìn)行適度的超聲處理，將細(xì)胞分散再進(jìn)行培養(yǎng)，可以使更多的微生物接觸培養(yǎng)基而得到培養(yǎng)。
四、結(jié)語(yǔ)
總之，由于微生物群落及其生存環(huán)境的復(fù)雜性，在任何情況下試圖大量培養(yǎng)微生物都不能僅局限于一種或幾種方法，而應(yīng)綜合采用多種有效的方法。另一方面，還應(yīng)在發(fā)展微生物培養(yǎng)技術(shù)的同時(shí)，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，使兩種方法相輔相成，更好地提高微生物的可培養(yǎng)性。
【微生物培養(yǎng)技術(shù)初探-農(nóng)業(yè)生物技術(shù)論文】相關(guān)文章：
生物技術(shù)論文10-01
生物技術(shù)對(duì)新型農(nóng)業(yè)技術(shù)的影響10-05
農(nóng)業(yè)推廣碩士培養(yǎng)措施論文10-08
藥學(xué)畢業(yè)生實(shí)習(xí)培養(yǎng)模式初探論文10-08
生物技術(shù)專(zhuān)業(yè)生物技術(shù)制藥教學(xué)改革探索論文10-08
小學(xué)教育中學(xué)生品德能力培養(yǎng)初探論文10-08