膽酸鹽與Cu2+離子相互作用的共振瑞利散射光譜及其分析應用研究論

　　目的 研究弱酸性介質中，牛磺膽酸鈉、甘牛膽酸鈉、膽酸鈉和脫氧膽酸鈉等4種膽酸鹽與Cu2+離子相互作用。方法 采用共振瑞利散射光譜。 結果 一定濃度的Cu2+離子能與膽酸鹽相互作用生成絡合物導致溶液RRS發生改變，并且散射強度IRRS顯著增強。不同膽酸鹽的反應產物具有相似的光譜特征，最大RRS波長均位于369 nm。在一定范圍內，膽酸鹽的濃度與散射強度（ΔIRRS）成正比。對于不同的體系其檢出限在36.8～66.2 ng/mL之間。 結論 方法靈敏度高、選擇性好、簡便快速，可用于市售蛇膽川貝液樣品中膽酸鹽的測定。
　　
　　Abstract:Objective To study the interaction of bile salts, namely sodium taurocholate, sodium tauroglycocholate, sodium deoxycholate and cow sodium cholate, with Cu2+ in acetic acid?sodium acetate buffer. Methods Resonance Rayleigh scattering (RRS) was used to analyze the interaction. Results Bile salts could react with Cu2+ to form ion association complexes, which would result in great enhancement of RRS. The RRS peaks were similar among the four reaction products. The maximum RRS peak was at 369 nm. The intensity of ΔIRRS was directly proportional to the concentration of bale salt in a certain concentration range. Their detection limits for the four bale salts, whose order of sensitivity from high to low ranks, were between 36.8 and 66.2 ng/mL. Conclusion This method not only has high sensitivity and good selectivity, but also simple and rapid. It can be used to analyze the bale salts and serum samples with satisfactory results.
　　
　　Key words:sodium taurocholate; sodium tauroglycocholate; sodium deoxycholate; sodium cholate; resonance Rayleigh scattering spectrum
　　
　　膽酸鹽是人和動物膽汁的主要成分，在機體中具有非常重要的生理功能。它們能調節膽固醇代謝，防止膽石生成，對脂肪的消化和吸收起著重要的作用［1］。由于一些膽鹽類藥物具有鎮咳、祛痰、平喘、消炎抗菌等特殊的藥效作用［2］，近年來膽鹽類制劑已廣泛應用于臨床治療。目前對膽酸鹽分析，以測定市售膽酸鹽制劑或膠囊中的膽酸鹽含量為主，主要方法有光度法［3］ 、薄層掃描法［4,5］、高效液相色譜法［6～8］等。
　　
　　共振瑞利散射（resonance rayleigh scattering， RRS）或共振光散射（resonance light scattering, RLS）是指當瑞利散射位于或接近于分子吸收帶時，電子吸收電磁波頻率與散射頻率相同，電子因共振而強烈吸收光的能量并產生再次散射這一物理現象［9］。作為一種新的分析技術，共振瑞利散射技術已在核酸、蛋白質、肝素等生物大分子、藥物、表面活性劑以及金屬和非金屬離子等的測定中得到越來越多的應用［10～12］。由于靜電作用、疏水作用以及電荷轉移作用對于RRS強度和光譜特征有重要影響，這就為通過離子締合反應用RRS技術研究金屬離子（或質子）和藥物分子間的相互作用奠定了基礎。對膽酸鹽研究工作，近年來主要集中在膽鹽膠團中膽汁酸的成分、種類及比例［13，14］，以及金屬離子對膽鹽膠團性質的影響［15～17］。對于膽酸鹽與金屬離子發生絡合作用，形成金屬膽汁酸絡合物的報道雖已很多，但多為紅外光譜、X射線粉末衍射及激光光散射光譜。我們曾采用RRS技術研究膽酸鹽在酸性介質中的聚集作用 ［18］，取得良好的效果。最近，我們研究了牛磺膽酸鈉(NaTC)、甘牛膽酸鈉(NaTGC)、膽酸鈉(牛)(NaC)及脫氧膽酸鈉(NaDC)等4種膽酸鹽在弱酸性條件下與Cu2+形成絡合物的共振瑞利散射光譜，研究發現，4種膽酸鹽與一定濃度的Cu2+均可發生絡合作用，并且產生散射強度顯著增強的RRS光譜，而且在一定范圍內，其散射強度與膽酸鹽的濃度成正比。結果表明方法簡便、快速，具有極高的靈敏度，對不同膽酸鹽的檢出限在36.8～66.2 ng/mL之間；方法具有較好的選擇性。將該法用于市售蛇膽川貝液中的膽酸鹽含量的測定，結果滿意。
　　
　　1  儀器與試劑
　　
　　Hitachi F?2500 型熒光分光光度計，測定參數，狹縫寬度10 nm，光電倍增管（PMT）負電壓為400 V；pHS?3C 型酸度計（上海大中分析儀器廠）；天美UV?VIS 8500 型分光光度計（天美公司，上海）。
　　
　　牛磺膽酸鈉（Sodium Taurocholate,NaTC；華美生物工程公司）；甘牛膽酸鈉（Sodium tauroglycocho?late,NaTGC；上海試劑二廠）；脫氧膽酸鈉（Sodium Deoxycholate,NaDC；華美生物工程公司）；膽酸鈉（牛）(Sodium Cholate,NaC；北京雙旋微生物培養基制品廠)均配成500.0 μg/mL的水溶液作為儲備液；CuSO4溶液，其中Cu2+的濃度為0.25 mol/L；用0.2 mol/L HAc和NaAc溶液按一定比例混合配制成不同pH值的HAc?NaAc緩沖溶液，并用酸度計校正；以上試劑都是分析純，實驗用水為二次蒸餾水。
　　
　　2  實驗方法
　　
　　依次取不同的膽酸鈉溶液各2 mL分別置10 mL比色管中，分別加入適當pH值的HAc?NaAc緩沖溶液1.0 mL，然后分別加入0.5 mol/L的CuSO4溶液0.5 mL,用水稀釋至刻度，搖勻，將溶液于熒光分光光度計上，以λem=λex進行同步掃描， 記錄共振瑞利散射光譜， 然后在最大共振瑞利散射峰（λmax）處測量散射強度IRRS和試劑空白I0, ΔIRRS=IRRS-I0。
　　
　　3  結果與討論
　　
　　3.1  共振瑞利散射光譜
　　
　　圖1為pH=5.0的HAc?NaAc緩沖溶液介質中4種膽酸鹽的共振瑞利散射光譜圖。 由圖1可見，膽酸鹽本身單獨存在時，其RRS信號均十分微弱。Cu2+單獨存在RRS信號也十分微弱，但是當在4種膽酸鹽溶液中加適當濃度的Cu2+時，則因膽酸鹽與Cu2+發生絡合作用而使RRS顯著增強，并產生新的RRS光譜。4種膽酸鹽顯示相似的光譜特征，其最大RRS波長均位于369 nm處。
　　
　　相同測定條件下不同的膽酸鹽相對RRS強度也略有不同。在pH=5.0的HAc?NaAc緩沖介質中，4種膽酸鹽的相對強度順序依次是NaTC、NaDC、NaC、NaTGC。
　　
　　3.2  適宜的反應條件
　　
　　3.2.1  緩沖溶液的選擇及其用量的影響
　　
　　比較BR（Rritton?Robinson)、HAc?NaAc、冰乙酸?乙酸銨等幾種緩沖溶液對形成絡合物的影響，發現4種體系均表現為在HAc?NaAc緩沖溶液中的RRS強度最大，因此選用HAc?NaAc緩沖溶液作為反應的介質。再比較不同酸度（pH 2.5～6.5）對反應體系的影響，結果表明，在pH 4.5?6.0 的范圍內絡合物的散射強度最大且空白較小(如圖2)，本實驗選pH 5.0的緩沖溶液。緩沖溶液用量在0.50～1.5 mL之間對于體系RRS強度影響不大（見圖3）。因此實驗中加入HAc?NaAc緩沖溶液1.0 mL。
　　
　　3.2.2  Cu2+濃度的影響
　　
　　考察在369 nm處Cu2+濃度對體系ΔIRRS的影響，如圖4所示。結果表明：當Cu2+濃度在0.2～0.4 mol/L的范圍內，ΔIRRS最大且穩定；Cu2+濃度太低（在<0.2 mol/L時），反應不完全，強度較弱；而濃度太高（>0.4 mol/L時），RRS強度也有所下降，也不利于反應。本實驗選取0.25 mol/L的Cu2+進行實驗。
　　
　　3.2.3  離子強度的影響
　　
　　以Cu2+?NaTC體系為例，考察離子強度（以NaCl計）對ΔIRRS的影響。結果表明，當NaCl濃度范圍在0.1～0.5 mol/L之間時，散射強度變化不大。
　　
　　3.2.4  散射強度的穩定性
　　
　　膽酸鈉溶液與Cu2+溶液混合放置20  min后，其散射強度達最大，隨后RRS強度一直比較穩定，至少保持12 h以上，實驗選擇在溶液混合0.5 h后進行測定。
　　
　　3.2.5  絡合物的組成
　　
　　以Cu2+?NaDC為例，用等摩爾連續變化法測定絡合物中Cu2+與NaDC的組成比，結果表明：Cu2+∶NaDC=1∶2,這說明絡合物可能的結構為Cu ［DC］2。
　　
　　3.3  反應機理探討
　　
　　膽酸鹽分子一般含有羥基取代的類固醇骨架，而其尾鏈一般為羧基(如NaDC,NaC,NaTGC)或磺酸基(如NaTC),從結構上可分為3類：
　　
　　(1)膽醇的硫酸酯：
　　
　　R·OH＋HOSO3-→R·O·SO3-＋H2O
　　
　　(2)膽汁酸與牛磺酸的結合物(如牛磺膽酸)：
　　
　　　R·COOH＋H2N·CH2·CH2·SO3- →R·CO·NH·CH2·CH2·SO3-＋H2O
　　
　　(3)膽汁酸與甘氨酸的結合物(如甘牛膽酸)：
　　
　　　R·COOH＋H2N·CH2·COOH  →R·CO·NH·CH2·COOH＋H2O
　　
　　膽酸鹽分子的碳氫骨架上均含有羧基氧和羥基氧，該氧原子具有一對孤對電子。而Cu2+在水溶液中以水合離子［Cu(H2O)4］2+形式存在，含有未充滿d的電子層，由于Cu2+離子能提供一定的空軌道作用，所以能與含有孤對電子氧原子的膽酸鹽發生絡合，生成金屬銅絡合物。當往低濃度的膽酸鹽單體溶液中引入一定濃度的Cu2+時，4種膽酸鹽均可觀察到RRS顯著增強，并且有新的RRS的光譜峰出現，證實了以上的推斷。因此Cu2+與膽酸鹽分子發生絡合作用，生成藍色的金屬銅絡合物或螯合物，是溶液的RRS顯著增強本質原因。見圖5。
　　
　　3.4  方法的選擇性
　　
　　以NaTC?Cu2+為例，比較了一些常見的離子、蛋白質、氨基酸及糖類對膽酸鹽測定的影響，結果見表1。一些常見的陰陽離子如Cl-、Br-、Na+、NO3-、及煙酸、尿素、蔗糖、葡萄糖等大分子的允許量較高，但是一些金屬離子Pb2+、Hg2+、Cd2+及H2PO4-、維生素B、血紅蛋白和部分氨基酸的允許量較低，加入少量EDTA作掩蔽劑，可使Fe3+的允許量提高。表1  共存物質的影響(略)
　　
　　3.5  散射強度與膽酸鹽類藥物濃度的關系
　　
　　分別取不同量的膽酸鈉藥物于10 mL比色管中， 按實驗條件操作， 并于最大波長和最佳條件下測試劑空白和配合物的RRS強度，求得ΔIRRS值，再分別以ΔIRRS對膽酸鹽的濃度作圖，繪制標準曲線，各體系檢出限（當信噪比S/N=3時）和定量測定范圍見表2。方法對4種膽酸鈉藥物的測定具有較高靈敏度。對不同膽酸鹽的檢出限在36.8～66.2 ng/mL之間。表2  標準曲線的相關系數，線性范圍和檢出限（略）
　　
　　4  分析應用
　　
　　將方法用于市售蛇膽川貝液中膽酸鹽含量的測定，分析考察本法的實用性，利用標準加入法測定市售蛇膽川貝液（江西南昌桑海制藥廠）中牛磺膽酸鈉的含量。取10 mL蛇膽川貝液置100 mL分液漏斗中，用三氯甲烷提取3次，每次15 mL，合并氯仿液，水浴蒸干，冷卻后定溶于50 mL的容量瓶中，取2 mL進行測定，結果見表3。由表3可看出，方法具有較好的回收率，RSD在2.9 %～5.9 %之間，表明本法可靠，可用于膽酸鹽制劑分析。表3  市售蛇膽川貝液中牛磺膽酸鈉的測定結果(略)

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