紫杉醇改變FADD在食管鱗癌中的表達

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　　【摘要】 目的 人食管鱗癌細胞株Eca109中Fas相關死亡結構域蛋白(Fas associated death domain protein, FADD)表達與 紫杉醇的關系影響分析,紫杉醇在食管鱗癌治療中的作用機制探討。方法 流式細胞術檢測不同濃度紫杉醇處理下，人食管癌細胞株Eca109細胞凋亡率，同時采用Western blotting分析細胞中FADD的表達變化。結果 紫杉醇誘導人食管癌細胞株Eca109細胞凋亡呈劑量依賴性;隨著紫杉醇劑量的增加，實驗組Eca109細胞中FADD表達呈顯著增高。結論 一定劑量的紫杉醇可以提高FADD在食管癌細胞中的表達、促進食管癌細胞的凋亡，這可能是紫杉醇治療食管癌的分子機制之一。

　　【關鍵詞】 紫杉醇;食管癌;凋亡;FADD

　　食管癌是常見消化道惡性腫瘤之一，其發病隱匿,確診時大多已屬于中晚期，使很多患者在手術前后需要接受化學治療,以確保手術效果，同時化療也為很多失去手術機會的患者提供了治療的機會。紫杉醇品名為Taxol，最早是Wall和Wani于1963 年從太平洋紅豆杉的皮中提取得到[1]，經過臨床試驗后近年來已經廣泛應用于臨床包括食管癌在內的多種腫

　　瘤的化療中。紫杉醇可作用于細胞凋亡受體途徑的Fas/FasL 通路或激活凋亡啟動途徑的半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶系統(caspases), 誘導細胞凋亡[2,3]，而FADD是Fas/FasL凋亡系統中的必需分子，不僅參與細胞凋亡過程的發生，還與細胞周期的調節有關。研究[4]證實從食管正常黏膜到不典型增生的組織中，FADD蛋白及mRNA表達呈現顯著下降趨勢。已有臨床研究[5,6]表明紫杉醇聯合順鉑、奈達鉑、氟尿嘧啶等藥物治療食管癌,可以提高其總有效率,且毒副作用無明顯增加，患者耐受性較好，表明紫杉醇在食管癌治療中具有很高的臨床應用價值。同時紫杉醇對人食管癌細胞的生長有明顯的抑制作用, 使細胞分裂阻滯于G2-M 期, 并誘導腫瘤細胞凋亡[7]。但現有研究并沒有對這一過程中食管癌細胞中FADD的表達變化情況作進一步研究。

　　作者通過檢測不同濃度紫杉醇誘導人食管鱗癌細胞株Ec-109 細胞凋亡,并檢測細胞表達FADD蛋白的變化情況，探討紫杉醇抑制人食管癌細胞增殖、誘導細胞凋亡的分子機制,為臨床應用提供實驗依據。

　　1 材料和方法

　　1.1 試劑與藥物 泰素(紫杉醇的商品名, 由百時美施貴寶公司惠供, 6 g/L, 分子質量8539 u)，RPMI1640培養液、005%的胰蛋白酶及小牛血清為Hyclone產品, Annexin V(FITC)/PI凋亡檢測試劑盒購于杭州隆基生物工程研究所, 蛋白提取液購于Pierce公司，兔抗人FADD單克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體購于Santa Cruz公司，考馬斯亮藍試劑盒購于南京建成生物科技有限公司。

　　1.2 細胞與細胞培養 人食管癌細胞株Eca-109(ATCC)由上海麥莎生物科技有限公司代購。細胞接種于含10% 小牛血清的RPMI 1640培養液培養, 生長于37℃含5% 的CO2孵箱中, 待細胞生長至對數生長期開始實驗。胰蛋白酶消化細胞后培養基重懸，調整細胞數為5×10.5/ml接種于6孔培養板進行培養， 24 h后更換新鮮培養液，同時實驗組培養液中分別加入終濃度為 5、10、20、50 nmol/L 泰素，對照組不加藥物，每個濃度設3個復孔，培養24 h后收集各組細胞。

　　1.3 凋亡檢測

　　收集每組細胞后PBS洗滌離心，細胞重懸于300 μl Banding buffer中，加入5 μl AnnexinV-FITC混勻，室溫避光孵育15 min，再加入5 μl PI，室溫避光孵育5 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率，同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為對照。

　　14 Western blotting 分別收集每組細胞，PBS洗滌離心后，加入含蛋白酶抑制劑的蛋白提取液，提取細胞總蛋白并調整蛋白濃度后100℃煮沸變性。取適量蛋白進行SDS-PAGE電泳，半干法轉膜，封閉，按1：1000分別孵育兔抗人FADD單克隆抗體及鼠抗人β-actin單克隆抗體，4℃過夜后洗膜，按1：1000分別孵育羊抗兔及羊抗鼠二抗，洗膜，化學發光底物顯影照相后進行圖片分析及數據采集。

　　1.5 統計學方法

　　以上實驗均重復3次，實驗數據采用SPSS 130軟件分析處理，統計學方法采用t檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<005表示差異有統計學意義。

　　2 結果

　　21 紫杉醇誘導人食管癌細胞株Eca-109凋亡檢測 實驗結果顯示，實驗組細胞凋亡率顯著高于對照組，實驗組中紫杉醇藥物濃度5 nmol/L組與10 nmol/L之間差異無統計學意義，藥物濃度升高至20 nmol/L和50 nmol/L后細胞凋亡率顯著升高，與5 nmol/L組和10 nmol/L之間差異有統計學意義，見圖1。

　　22 細胞表達FADD 蛋白水平檢測 檢測結果顯示，所有實驗組中Eca-109細胞表達FADD蛋白水平較對照組均有升高，見圖2，a。但僅紫杉醇藥物濃度為20 nmol/L組和50 nmol/L組中細胞表達

　　3 討論

　　研究結果顯示，紫杉醇能誘導人食管癌細胞株Eca-109細胞凋亡，當紫杉醇濃度達到20 nmol/L和50 nmol/L時，細胞凋亡率顯著升高。這一研究結果提示，只有紫杉醇達到一定血藥濃度后，才會對食管癌細胞產生抗癌作用。低濃度紫杉醇作用可能只會抑制細胞增殖，并不一定能引起食管癌細胞的凋亡。FADD是FAS受體和部分TNF死亡受體家族成員介導信號通路中的胞質死亡信號銜接蛋白，其羧基端的死亡結構域DD與Fas分子胞漿段內的DD結合，當Fas與FasL結合導致Fas胞內的死亡域形成三聚體而活化,并引起與之結合的FADD構象改變,使Caspase- 8前體集聚、斷裂和激活,產生有活性的Caspase - 8,從而激發一系列下游的Caspase - 3 等級聯反應, 誘發細胞凋亡[8]。檢測結果顯示，當紫杉醇誘導人食管癌細胞株Eca-109細胞凋亡時，細胞表達FADD蛋白水平顯著升高，而低濃度組之間差異無統計學意義。這表明紫杉醇可能通過Fas/FasL途徑在食管癌治療中起作用，一定劑量的紫杉醇可以誘導食管癌細胞FADD表達水平的升高，促進癌細胞凋亡。這也提示在抗腫瘤治療過程中，紫杉醇的用量也是關鍵。

　　食管癌的治療是一個綜合治療的過程，化療只是所有治療方法中的一種。紫杉醇雖然在食管癌臨床治療中已經顯現出一定的價值，但仍無法徹底改變食管癌疾病的預后。作者也僅僅選用了食管癌中的鱗癌細胞株作研究，還不能代表食管癌所有病理類型，將進一步深入研究，以期能為食管癌的治療提供更為有價值的理論基礎。

　　參 考 文 獻

　　[1] Wani M C, Taylor H L, Wall M E,et al. Am. Chem. Soc, 1971, 93:2325-2327.

　　[2] Ferreira CG, Tolis C,Span SW,et al. The Fas/FasL(CD 95/A PO 1)signaling pathway does not mediate drug-induced apoptosis in lung cancer cells.Clin Cancer Res, 2000,6(1):203-212.

　　[3] Essmann F, Wieder T,Otto A,et al. GDP dissociation inhibitor D4-G DI(Rho-GDI2), but not the homologous Rho-GDI1,is cleaved by caspase-3 during drug-induced apoptosis. Biochem J,2000,346:777-783.

　　[4] 許欣,彭林濤,劉麗華,等.食管上皮癌變過程中FAS、FASL、FADD和caspase-8的表達及其意義.基礎醫學與臨床,2007，5(27)：525-529.

　　[5] 張永香.108例晚期食管癌的藥物治療與分析.中國現代藥物應用,2010(14):109-110.

　　[6] 龐東生.紫杉醇聯合奈達鉑和氟尿嘧啶治療晚期食管癌的臨床觀察.臨床腫瘤學雜志,2010,15(2):169-170

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